यहाँ, हम murine आँख है कि रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के नुकसान में परिणाम के रूप में मनाया मोतियाबिंद में आंख का उच्च रक्तचाप प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। चुंबकीय microbeads पूर्वकाल कक्ष में इंजेक्शन और जलीय हास्य का बहिर्वाह ब्लॉक करने के लिए एक चुंबक का उपयोग iridocorneal कोण करने के लिए आकर्षित कर रहे हैं।
मोतियाबिंद के कृंतक मॉडल के उपयोग के आणविक तंत्र है कि इस multifactorial neurodegenerative रोग के pathophysiology आबाद समझने के लिए आवश्यक हो गया है। कई ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के आगमन के साथ, वहाँ आंख का उच्च रक्तचाप के inducible murine मॉडल में बढ़ती रुचि है। यहाँ, हम एक Facetted उठाव के साथ एक संशोधित Microneedle का उपयोग कर चुंबकीय microbeads के इंजेक्शन आंख के पूर्वकाल कक्ष में मोतियाबिंद के आधार पर की एक रोड़ा मॉडल प्रस्तुत करते हैं। चुंबकीय microbeads iridocorneal कोण पूर्वकाल कक्ष से जलीय हास्य की जल निकासी ब्लॉक करने के लिए एक हाथ में चुंबक का उपयोग करने के लिए आकर्षित कर रहे हैं। intraocular दबाव है, जो बाद में, रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के नुकसान की ओर जाता है के रूप में मानव मोतियाबिंद रोगियों में मनाया की एक सतत ऊंचाई में जलीय गतिशीलता परिणामों में यह व्यवधान। microbead रोड़ा इस पांडुलिपि में प्रस्तुत मॉडल मोतियाबिंद के अन्य inducible मॉडल और भी अत्यधिक की तुलना में है सरलप्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य। महत्वपूर्ण बात है, यहाँ प्रस्तुत संशोधनों के आम मुद्दों है कि अक्सर रोड़ा मॉडल में उत्पन्न होती हैं कम से कम। सबसे पहले, एक bevelled कांच Microneedle का उपयोग microbeads की backflow रोकता है और यह सुनिश्चित करता है कि कम से कम नुकसान इंजेक्शन के दौरान कॉर्निया के लिए होता है, इस प्रकार की चोट से संबंधित प्रभाव को कम करने। दूसरा, चुंबकीय microbeads के उपयोग की क्षमता iridocorneal कोण करने के लिए सबसे मोतियों को आकर्षित करने के लिए प्रभावी ढंग से पूर्वकाल कक्ष अन्य संरचनाओं के साथ संपर्क से बचने में तैर मोती (उदा।, आईरिस, लेंस) की संख्या को कम करता है। अन्त में, एक हाथ में चुंबक का उपयोग करें जब कुशलता चुंबकीय microbeads प्रत्यक्ष और यह सुनिश्चित आंख से microbeads के छोटे भाटा है कि जब Microneedle वापस ले लिया है करने के लिए छोटे माउस आंख से निपटने लचीलापन देता है। सारांश में, microbead रोड़ा माउस यहाँ प्रस्तुत मॉडल neurodegenerative परिवर्तन है कि शुरुआत और Glau की प्रगति के दौरान होने अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली खोजी उपकरण हैकोमा।
ग्लूकोमा एक प्रगतिशील और अपरिवर्तनीय चकाचौंध शर्त यह है कि 2020 1 द्वारा दुनिया भर में एक अनुमान के अनुसार 80 लाख लोगों को प्रभावित करेगा। मोतियाबिंद रोगियों में, दृष्टि हानि रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs), उत्पादन न्यूरॉन्स कि से दृश्य जानकारी प्रेषित की चयनात्मक मौत के कारण होता है मस्तिष्क के लिए रेटिना। ग्लूकोमा एक उम्र से संबंधित कई जोखिम कारकों के साथ neurodegenerative रोग जिनमें से सबसे आम बुलंद intraocular दबाव (आईओपी) है। मोतियाबिंद और वर्तमान उपचार आंख दबाव के प्रबंधन पर पूरी तरह ध्यान केंद्रित में दरअसल, IOP केवल परिवर्तनीय जोखिम कारक है। हालांकि, कई आनुवंशिक सेलुलर, और पर्यावरणीय कारकों शुरुआत है और इस रोग की प्रगति को प्रभावित करते हैं। इसलिए, विभिन्न तंत्रों कि अंततः neuronal मौत के लिए योगदान को समझने के मोतियाबिंद के लिए प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए आवश्यक है।
मोतियाबिंद के पशु मॉडल रोग pathophysiology अध्ययन करने के लिए और पहचान और परीक्षण करने के लिए आवश्यक हैंहोनहार चिकित्सा विज्ञान। सशर्त पीटकर तनाव और चूहों आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट ट्रेसर ले जाने सहित ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की बढ़ती उपलब्धता inducible murine मोतियाबिंद मॉडल के लिए जरूरत प्रेरित किया है। मोतियाबिंद के कई कृंतक मॉडल वर्ष (2,3 में समीक्षा) में विकसित किया गया है। इन मॉडलों में से कई में, मोतियाबिंद जलीय हास्य गतिशीलता में खलल न डालें, IOP की पदोन्नति में जिसके परिणामस्वरूप से प्रेरित है। रोड़ा मॉडल, जिसमें microbeads या अन्य पदार्थ आंख के पूर्वकाल कक्ष में इंजेक्शन हैं जलीय जल निकासी ब्लॉक करने के लिए, आंशिक रूप से IOP 4-14 बढ़ाने के लिए उनके रिश्तेदार आसानी के कारण हाल के वर्षों में लोकप्रियता हासिल की है।
मोतियाबिंद के microbead रोड़ा मॉडल, पहली प्राइमेट 12 में किए गए, खरगोशों 8, और चूहों 4,9,11, हाल ही में चूहों 5,6,10 में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। इन अध्ययनों में, polystyrene microbeads की intracameral इंजेक्शन, अकेले या मेंएक viscoelastic सामग्री के साथ संयोजन, बाद में RGC मौत 6,10 करने के लिए अग्रणी IOP पदोन्नति में हुई। हालांकि, भाटा जब सुई आंख और iridocorneal कोण से microbeads की dislodging से वापस ले लिया है आम समस्या है कि प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं। इन कमियों को कम से कम करने के लिए, मैग्नेट आंख 4,9 के iridocorneal कोण करने के लिए चुंबकीय microbeads आकर्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल पिछले अध्ययनों 9,10 चुंबकीय microbeads और एक हाथ में चुंबक माउस आंख के लिए अनुकूलित (चित्रा 1) का उपयोग करता है के आधार पर एक संशोधित प्रक्रिया है। कई महत्वपूर्ण संशोधनों हमारे प्रोटोकॉल में पेश किया गया है चूहों में प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य IOP वृद्धि सुनिश्चित करने के लिए। सबसे पहले, microbeads के इंजेक्शन एक Facetted उठाव के साथ एक सावधानी से तैयार कांच Microneedle का उपयोग किया जाता है। Microneedle के परिणामस्वरूप चिकनी सतहों के साथ ही इसकी तेज टिप सुनिश्चित करता है कि कम से कम नुकसान हैप्रवृत्त के रूप में यह कॉर्निया punctures। इस गिलास Microneedle का उपयोग भी बढ़ा नियंत्रण में परिणाम है जब microneedle टिप पूर्वकाल कक्ष में प्रवेश करती है, जिससे इस तरह के आईरिस और लेंस के रूप में हानिकारक पास संरचनाओं के जोखिम को कम करने। इसके अलावा, छोटे इंजेक्शन घाव कार्निया स्वयं की मरम्मत की सुविधा और अवांछित चोट से संबंधित प्रभाव कम कर देता है।
दूसरा, चुंबकीय microbeads के इंजेक्शन और एक हाथ में चुंबक के उपयोग के सटीक नियंत्रण छोटे माउस आंखों में iridocorneal कोण करने के लिए मोती आकर्षित करने के लिए अनुमति देते हैं। चुंबकीय microbeads कि क्योंकि इस microbead आकार तैयार Microneedle उद्घाटन रोकना नहीं था और महत्वपूर्ण बात, एक बार इंजेक्शन व्यास में 4.5 माइक्रोन का इस्तेमाल किया गया है, इन microbeads प्रभावी ढंग से जलीय हास्य की जल निकासी अवरुद्ध। यह दृष्टिकोण न केवल इंजेक्शन microbeads की भाटा कम कर देता है, लेकिन यह भी सुनिश्चित करता है कि microbeads की अधिकतम संख्या लक्षित क्षेत्र में जम जाता है को प्रभावी ढंग से जलीय हास्य जल निकासी ब्लॉक करने के लिए। furthermore, इस रणनीति भी पूर्वकाल कक्ष ऐसे आईरिस और लेंस, और पीछे कक्ष को रोकने के पारित होने के रूप में अन्य संरचनाओं, साथ संपर्क से बचने में तैर मोतियों की संख्या कम कर देता है। सामूहिक रूप से, इन संशोधनों सुनिश्चित करना है कि microbead इंजेक्शन सर्जरी रिश्तेदार आसानी से और एक समय पर ढंग से चूहों में आंख का उच्च रक्तचाप के एक अत्यधिक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, प्रभावी और निरंतर प्रेरण, जिसके परिणामस्वरूप में किया जाता है।
यहाँ प्रस्तुत वीडियो तकनीक कैसे चुंबकीय microbeads की intracameral इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए प्रभावी ढंग से और reproducibly चूहों में IOP ऊंचाई के लिए प्रेरित करने के बारे में विस्तृत कदम-दर-कदम निर्देश प्रदान करता है। निरंतर IOP वृद्धि हुई है कि अतिरिक्त इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है और नेत्र उच्च रक्तचाप induction.Elevated IOP के पहले 3 सप्ताह के भीतर detectable RGC सोमा और अक्षतंतु घटाने को बढ़ावा देता में इस प्रक्रिया का परिणाम मनुष्यों में मोतियाबिंद के विकास के लिए एक बड़ा जोखिम कारक है। इसलिए, यह एक महत्वपूर्ण murine आंख का उच्च रक्तचाप पर निर्भर मोतियाबिंद मॉडल आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए क्षमता है।
एक आम पूर्वकाल कक्ष में microbeads के इंजेक्शन के साथ जुड़े दोष यह इंजेक्शन साइट के माध्यम से भाटा मनका के लिए जब सुई वापस ले लिया है, जो अक्सर जलीय बहिर्वाह और वृद्धि की परिवर्तनशीलता का केवल आंशिक रुकावट में परिणाम से संबंधित है। इस मुद्दे के समाधान के लिए, कई महत्वपूर्ण संशोधनों को लागू किया गया। एफआइआर टी, एक Facetted उठाव के साथ एक साफ, तेज कांच Microneedle से सावधान तैयारी microbeads के सफल इंजेक्शन के लिए आवश्यक है। एक ठीक से तैयार Microneedle नाजुक सतह नेत्र करने के लिए दबाव के कम से कम आवेदन के साथ कॉर्निया की नियंत्रित और चिकनी प्रवेश सक्षम बनाता है। छोटे कार्निया पंचर microbeads की backflow रोकता है। इसके अलावा, ठीक Microneedle ऐसे आईरिस और लेंस के रूप में हानिकारक पास संरचनाओं, जो गैर-रोग से संबंधित सूजन में परिणाम सकता है के जोखिम को कम करता है। दूसरे, दौरान और इंजेक्शन के बाद सामरिक नेत्र क्षेत्रों के लिए एक हाथ में चुंबक के आवेदन के लिए इस तकनीक का एक और महत्वपूर्ण पहलू है। इंजेक्शन के दौरान, चुंबक जब Microneedle वापस ले लिया है microbeads के पूर्वकाल चैम्बर रोकने भाटा के चुंबकीय microbeads आकर्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इंजेक्शन के बाद, चुंबक तो जलीय हास्य बहिर्वाह ब्लॉक करने के लिए iridocorneal कोण करने के लिए microbeads निर्देशित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
तम्बू "> अक्सर microbead रोड़ा मॉडल में एक और समस्या का सामना करना पड़ा है कि दोहराया मनका इंजेक्शन अक्सर IOP ऊंचाई 10,11। यह iridocorneal कोण से साथ समय है। एक हाथ में चुंबक के संयोजन dislodging microbeads का नतीजा हो सकता है निरंतर प्राप्त करना आवश्यक हो जाता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है, और माउस की स्थिति के बाद operatively बहुत परिणाम में सुधार। इंजेक्शन anesthetics, जो लचीलापन प्रक्रिया के दौरान सिर ले जाने और एक लंबी पोस्ट ऑपरेटिव वसूली अवधि की आवश्यकता के लिए अनुमति का उपयोग करते हैं, के पक्ष में है। प्लेसमेंट की संचालित नेत्र शल्य चिकित्सा के बाद कुछ घंटों के लिए ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ माउस iridocorneal कोण पर microbeads के निपटारे के लिए योगदान देता है और पूर्वकाल कक्ष में वापस dislodging का खतरा कम हो जाती है।यह सुनिश्चित करना है कि इंजेक्शन मोतियों की संख्या अपेक्षाकृत संगत है अंतर-पशु रूपों को कम से कम करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है। चूंकि microbeads ख बसाottom ट्यूब की, यह पूरी तरह से microbead समाधान homogenize और एक समय पर ढंग से microneedle में उचित मात्रा को वापस लेने के लिए आवश्यक है। पूर्वकाल कक्ष में कम मोती इंजेक्शन जलीय हास्य जल निकासी संरचनाओं की अधूरी रुकावट है, जो गरीब या चर IOP ऊंचाई में परिणाम की संभावना है हो सकता है। ध्यान से, हालांकि microbead इंजेक्शन का परम उद्देश्य IOP तरक्की की है, सावधानी से लिया जाना चाहिए जब जाग चूहों से IOP माप पीक मूल्यों इस अध्ययन (~ 25 एमएमएचजी) की रिपोर्ट में की तुलना में अधिक है। अत्यंत उच्च IOPS इस्कीमिक नुकसान के जोखिम को बढ़ाने के लिए और भी जानवर को दर्द का कारण हो सकती है। IOP की ऊंचाई कई कारकों सर्जरी की सफलता का आकलन करने के लिए एक के रूप में माना जाना चाहिए। जैसे, प्रक्रिया के परिणाम IOP ऊंचाई, RGC सोमा मौत, और अक्षतंतु नुकसान सहित कई मापदंडों के आधार पर लगाया जाना चाहिए।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल सबसे microbeads सफल परिणाम में यद्यपिLy कोण पर बसने से, इस मॉडल का एक संभावित सीमा यह है कि उन मोतियों कि पूर्वकाल कक्ष में तैरते रहते हैं कॉर्निया के माध्यम से लाइव रेटिना इमेजिंग, साथ ही electrophysiological या व्यवहार assays जो प्रकाश के प्रभावी पारित होने की आवश्यकता के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए जब इस microbead रोड़ा मॉडल का उपयोग कि IOP ऊंचाई और बाद में RGC अध: पतन की हद तक उम्र और ऑपरेशन माउस [4] के आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ बदलता रहता है। इसलिए, IOP ऊंचाई की हद और RGC अध: पतन के समय प्रत्येक विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस लाइन और / या आयु सीमा के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी।
इस मॉडल की एक विशेषता यह है कि microbead इंजेक्शन, और महत्वपूर्ण RGC मौत के बाद पहले तीन हफ्तों के दौरान RGC मौत का क्रमिक नुकसान में ऊंचा IOP परिणाम प्रक्रिया के बाद 3 सप्ताह में पाया जाता है। इसलिए, इस मॉडल जल्दी और / या सूक्ष्म परिवर्तन है कि इस विकास में घटित की परीक्षा में सक्षम बनाता हैisease, पूर्व RGC सोमा और अक्षतंतु नुकसान प्रकट करने के लिए। RGC मौत में एक उल्लेखनीय वृद्धि 3 और 6 सप्ताह के बीच आंख का उच्च रक्तचाप के शामिल होने के बाद नहीं मनाया गया। सफल के बावजूद 25 3 और 6 सप्ताह के बीच% और इन बिंदुओं पर समय IOP ऊंचाई निरंतर – वास्तव में, RGC सोमा और अक्षतंतु नुकसान ~ 22 पर स्थिर बने रहे। निरंतर IOP की एक लंबी अवधि के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल / 6 चूहों, जो अन्य माउस उपभेदों की तुलना में अधिक RGC क्षति के लिए प्रतिरोधी हो दिखाई देते हैं C57BL में होने के अतिरिक्त RGC घटाने के लिए आवश्यक हो सकता है। 5 अतिरिक्त संशोधनों, मनका आकार का समायोजन सहित और अतिरिक्त इंजेक्शन, बाद में समय बिंदुओं पर RGC नुकसान का अध्ययन करने की आवश्यकता हो सकती है। इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल जल्दी pathophysiological परिवर्तन है कि मामूली RGC neurodegeneration जो शुरुआत और मानव मोतियाबिंद के शुरू में प्रगति के लिए प्रासंगिक हैं के साथ संबंध स्थापित करने पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए आदर्श है।
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.
Puller | Narishige | PC-10 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4°C. |
Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
25 mL serological pipet | Costar | 4489 | |
Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
P1000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
Microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690 | |
P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
0.2 mL PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
Ketamine | Controlled substance | ||
Xylazine | Bayer Healthcare | ||
Acepromazine | Vetoquinol | ||
U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
Balance | Ohaus | CS 200 | |
Buprenorphine | Controlled substance | ||
Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
Dissection tools | |||
Small brush | |||
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
Aluminum foil | |||
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |