皮层肌动蛋白流通过结构照明显微镜数据的时空图像相关光谱量化性T细胞
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
丝状肌动蛋白起着在大多数细胞过程，包括运动，并在免疫细胞，被称为免疫突触的关键细胞间相互作用的形成至关重要的作用。 F-肌动蛋白还可以推测，以在细胞中包括子膜囊泡动力学和蛋白质聚类的膜调节分子分布发挥作用。虽然标准的光学显微镜技术，允许进行广义和衍射极限的观察，许多细胞和分子事件，包括集群和分子流发生在人群的长度尺度远远低于标准光学显微镜的分辨能力。通过全内反射荧光结合超分辨率成像方法结构照明显微镜，记录F-肌动蛋白中的T细胞的免疫突触二维分子流。时空图像相关光谱（STICS）随后被施加，其产生量化resulTS在速度直方图和代表流动方向性和大小的矢量地图的形式。这个协议描述的超分辨率成像和STICS技术相结合，以产生在细节的子衍射水平流矢量。这个技术被用于确认一个肌动蛋白的流动是对称逆行和向心力整个T细胞的周后突触的形成。
Introduction
该实验的目标是图像，并为了在免疫突触（IS）的形成建立流动方向和幅度表征filamentous-（F – ）的肌动蛋白的分子流在活的T细胞，超出衍射极限。这种技术将进行使用结构照明显微镜（SIM）中的全内反射荧光（TIRF）模式，成像的Jurkat T细胞上形成激活盖玻片包被有抗CD3-和抗CD28抗体的人工突触。 T细胞和目标之间的IS形式;抗原呈递细胞（APC）在T细胞受体（TCR）活化1,2。由于这是在确定是否适应性免疫系统产生要感染的免疫应答的第一步，不正确的响应性对刺激的后果可能导致许多疾病。的T细胞的APC相互作用的重要性是有据可查的，然而，初始TCR SI后成熟的作用（S）为gnal内化是尚未得到充分的理解。
作为细胞骨架被认为有助于两个链接到TCR活化（分子在质膜的移动和信号分子依赖于肌动蛋白骨架3,4的控制），了解如何细胞骨架重排的空间过程和时间上会阐明的步骤在突触形成的分子重组。 F-肌动蛋白逆行流动被认为是托起TCR集群对免疫突触的中心，这种易位被认为是信号停止和回收至关重要;辅助T细胞活化5的良好的平衡。
而标准荧光显微镜是一种灵活的工具，继续提供对多生物学事件，包括细胞 – 细胞相互作用的洞察力，它是由该系统的准确地解决多个荧光团位于比DIFFR接近能力的限制对方的行动限制（≈200纳米）。当细胞内的许多分子事件涉及的分子密集的人口，并表现出无论是在静止状态或在特定的刺激动态重配置，常规光学显微镜不能提供完整的图片。
采用超分辨率成像已经使研究人员能够绕过使用多种技术的衍射极限。单分子定位显微镜（SMLM）如PALM和STORM 6,7-必须解决分子的位置最多约20纳米的精度的能力，然而，这些技术依赖于长采集时间，建立一个图像在许多帧。通常这要求样品是固定的或对结构表现出低移动性，以便单一荧光团不误解为多个点。而受激发射损耗（STED）成像允许超分辨率通过非常有选择性的共焦激发8，所需的扫描方法可以是在视全细胞字段慢。受激发射损耗还演示显著光毒性更高的分辨率增加所致在耗尽光束的功率。
结构照明显微镜（SIM 9）提供了一个替代这些方法，能够在标准的荧光显微镜的分辨率增加一倍，并且是与活细胞成像比目前SMLM技术更兼容。它采用较低的激光功率，在一个宽视场系统的视图全细胞领域;提供更高的采集速度，并与标准荧光标记兼容。 SIM的宽视场的性质也允许全内反射荧光（TIRF），用于高选择性激励的利用率，以在<100纳米的轴向尺寸的穿透深度。
图像相关光谱（ICS）是荧光强度相关的波动的方法。 ICS的演变;时空IM年龄相关光谱（STICS 10）相关的时间和空间内的荧光信号。通过关联像素强度与经由相关函数围绕滞后帧中的像素，将信息获得关于流的速度和方向。为了确保静态对象不与STICS分析干扰，不动的对象滤波器实现的，它的工作原理是减去像素强度的移动平均值。
这里提出的技术被认为是图像相关光谱的被施加到超分辨率显微镜数据，量化活细胞11的分子流的第一个示范。此方法对经由STICS分析12 F-肌动蛋白流衍射限制成像改进并会适合研究者谁希望确定二维分子流在活细胞中，从在超出光的衍射极限的空间分辨率获得的数据。
Protocol
Representative Results
Discussion
该技术将允许研究人员的形象和以前无法解决的量化细节细胞表达荧光。在我们的结果，我们表明，F-肌动蛋白以对称方式从向小区中心中的T细胞是细胞周流动。这些发现与来自1D线轮廓kymograph数据13之前的结果一致，并延伸分析的能力，以二维和超分辨率数据。
所提出的技术是从kymograph成像它仅限于通过单个1D线随时间绘制荧光强度波动进展。在比较当前技术允许全…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
Referências
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