Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
-Actina filamentosa juega un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, incluyendo la motilidad y, en las células inmunes, la formación de una interacción célula-célula clave conocida como la sinapsis inmunológica. F-actina También se especula que desempeñan un papel en la regulación de las distribuciones moleculares en la membrana de las células incluyendo la dinámica de vesículas sub membranosa y la agrupación de proteínas. Si bien las técnicas de microscopía de luz estándar permiten observaciones generalizadas y difracción de limitarse a realizar, muchos eventos celulares y moleculares, incluyendo clustering y el flujo molecular se producen en las poblaciones en longitud escalas muy por debajo de la capacidad de resolución del microscopio óptico estándar. Mediante la combinación de fluorescencia total reflexión interna con el súper resolución de imagen método estructurado iluminación microscopía, se registró el flujo molecular bidimensional de F-actina en la sinapsis inmunitaria de las células T. Espacio-temporal espectroscopia de correlación de imágenes (STICS) y luego se aplicó, que genera resul cuantificablets en forma de histogramas de velocidad y mapas vector que representa la direccionalidad del flujo y la magnitud. Este protocolo describe la combinación de las técnicas de imagen y STICS super-resolución para generar vectores de flujo a nivel sub-difracción de detalle. Esta técnica se utilizó para confirmar un flujo de actina que es simétricamente retrógrada y centrípeta lo largo de la periferia de las células T en la formación de sinapsis.
Introduction
El objetivo del experimento es a la imagen y caracterizar el flujo molecular de filamentous- (F-) de actina en las células T de estar, más allá del límite de difracción con el fin de establecer la dirección del flujo y la magnitud durante la sinapsis inmunológica (IS) formación. Esta técnica se llevará a cabo usando un microscopio de iluminación estructurada (SIM) en el modo de fluorescencia total reflexión interna (TIRF), la formación de imágenes de células T Jurkat que forman una sinapsis artificial sobre la activación cubreobjetos recubiertos con anticuerpos anti-CD28 anti-CD3 y. Las formas se encuentra entre una célula T y su objetivo; una célula presentadora de antígeno (APC) al receptor de células T (TCR) 1,2 activación. Como este es el primer paso para determinar si el sistema inmune adaptativo genera una respuesta inmune a una infección, las consecuencias de la capacidad de respuesta a los estímulos incorrecta puede causar una serie de enfermedades. La importancia de la interacción de células T-APC está bien documentada, sin embargo, el papel (s) del madura es después si inicial TCRinternalización gnal son todavía ser plenamente comprendido.
Como se cree que el citoesqueleto para ayudar a dos procesos ligados a la activación de TCR (el movimiento de las moléculas en la membrana plasmática y el control de las moléculas de señalización dependientes de la actina del citoesqueleto 3,4), la comprensión de cómo el citoesqueleto reorganiza espacial y temporalmente se dilucidar los pasos de la reorganización molecular durante la formación de sinapsis. Se cree que el flujo retrógrado de F-actina de corral racimos de TCR hacia el centro de la sinapsis inmunológica, se cree que esta translocación a ser vital para dejar de señal y el reciclado; ayudar al delicado equilibrio de la activación de las células T 5.
Mientras que la microscopía de fluorescencia estándar es una herramienta flexible que sigue ofreciendo una visión sobre muchos eventos biológicos, incluyendo interacciones célula-célula, está limitado por la capacidad del sistema para resolver con precisión múltiples fluoróforos que residen más cerca que el diffrlímite de acción (≈200 nm) uno del otro. Como muchos eventos moleculares dentro de las células involucran poblaciones densas de moléculas y exhiben reordenamiento dinámico, ya sea en reposo o con la estimulación específica, microscopía óptica convencional no proporciona una imagen completa.
El uso de imágenes de súper resolución ha permitido a los investigadores para eludir el límite de difracción usando una variedad de técnicas. Microscopía sola molécula de localización (SMLM), tales como palma y 6,7 STORM tiene la capacidad de resolver la ubicación de las moléculas hasta una precisión de alrededor de 20 nm, sin embargo, estas técnicas se basan en largos tiempos de adquisición, la construcción de una imagen sobre muchos marcos . Generalmente esto requiere muestras sean fijos o estructuras para exhibir baja movilidad fluoróforos tan solo no están mal interpretado como múltiples puntos. Si bien el agotamiento de la emisión estimulada (STED) de imágenes permite super-resolución a través de muy selectivo de excitación confocal 8, el escaneo requeridoenfoque puede ser lento sobre los campos de células enteras de vista. STED también demuestra fototoxicidad significativa para resoluciones más altas debido al aumento de la potencia del haz de agotamiento.
Microscopía de iluminación estructurada (SIM 9) ofrece una alternativa a estos métodos, capaces de duplicar la resolución de un microscopio de fluorescencia estándar y es más compatible con imágenes de células vivas que las técnicas actuales SMLM. Utiliza los poderes de láser más bajos, en un sistema de gran campo para los campos de células enteras de vista; proporcionando una mayor velocidad de adquisición, y es compatible con el etiquetado fluoróforo estándar. La naturaleza de campo amplio de SIM también permite la utilización de fluorescencia total reflexión interna (TIRF) para la excitación altamente selectivo, con profundidades de penetración en la dimensión axial de <100 nm.
Espectroscopia de correlación de imagen (ICS) es un método de correlación de las fluctuaciones en la intensidad de fluorescencia. Una evolución del ICS; Im espacio-temporaledad correlación de espectroscopia (STICS 10) correlaciona señales fluorescentes intracelulares en tiempo y espacio. Al correlacionar las intensidades de píxeles y la zona píxeles en marcos rezagados a través de una función de correlación, se obtiene información sobre las velocidades de flujo y direccionalidad. Para asegurar objetos estáticos no interfieren con el análisis STICS, un filtro de objetos inmóviles se implementa, que funciona restando una media móvil de las intensidades de los píxeles.
La técnica que aquí se presenta se cree que es la primera demostración de la espectroscopia de correlación de imágenes que se aplica a los datos de microscopía de super-resolución para cuantificar el flujo molecular en células vivas 11. Este método mejora en las imágenes de difracción limitada del flujo de F-actina a través de análisis STICS 12 y se adaptaría a los investigadores que deseen determinar el flujo molecular bidimensional en células vivas, a partir de los datos adquiridos con resoluciones espaciales más allá del límite de difracción de la luz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica permitirá a los investigadores a imagen y cuantificar previamente detalles irresolubles en células que expresan la fluorescencia. En nuestros resultados nos muestran que la F-actina fluye en una forma simétrica de la periferia de la célula hacia el centro de la celda en la célula T es. Estos resultados son consistentes con los resultados anteriores de la línea 1D datos de perfil quimógrafo 13 y se extienden la capacidad de análisis de datos 2D y super-resolución.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
Referências
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