Kortikal Actin Flow i T-celler kvantifieras genom Spatio-temporal bild korrelationsspektroskopi av Structured belysning mikroskopi Data
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
Filamentöst-aktin spelar en avgörande roll i en majoritet av cellprocesser inkluderande motilitet och, i immunceller, bildandet av en nyckel cell-cell-interaktion kallas den immunologiska synapsen. F-aktin är också spekulerats spela en roll vid reglering av molekylfördelningen vid membranet hos celler inklusive sub-membranös vesikel dynamik och protein klustring. Medan standardljusmikroskop tekniker tillåter generaliserade och diffraktionsbegränsad observationer göras, många cellulära och molekylära händelser, inklusive klustring och molekylär flöde förekommer i populationer på längdskalor långt under upplösningsförmåga standardljusmikroskop. Genom att kombinera total inre reflektion fluorescens med superupplösning avbildningsmetod strukturerad belysning mikroskopi, var två-dimensionell molekylär flöde av F-aktin vid immun synapsen av T-celler registrerats. Spatiotemporala bildkorrelationsspektroskopi (STICS) anbringades därefter, som genererar mätbara results i form av hastighets histogram och vektorkartor som representerar flödesrikt och omfattning. Detta protokoll beskriver en kombination av super-upplösning bild- och STICS teknik för att alstra flödesvektorer på sub-diffraktion detaljnivåer. Denna teknik användes för att bekräfta en aktin flöde som är symmetriskt retrograd och centripetal hela periferin av T-celler vid synapserna bildas.
Introduction
Målet med experimentet är att bilden och karakterisera den molekylära flödet av filamentous- (F-) aktin i levande T-celler, utöver diffraktionsgränsen för att fastställa flödes riktning och storlek under immunologisk synaps (IS) bildning. Denna teknik kommer att genomföras med hjälp av en strukturerad belysningsmikroskop (SIM) i total inre reflektion fluorescens (TIRF) läget, avbildning Jurkat T-celler som bildar en konstgjord synaps om hur du aktiverar täck belagda med anti-CD3- och anti-CD28-antikroppar. De IS bildas mellan en T-cell och dess mål; en antigenpresenterande cell (APC) vid T-cellreceptor (TCR) aktivering 1,2. Eftersom detta är det första steget för att avgöra om det adaptiva immunsystemet genererar ett immunsvar mot en infektion, kan konsekvenserna av felaktig respons till stimuli orsaka en rad sjukdomar. Betydelsen av T-cells APC interaktion är väl dokumenterad, dock är den roll (er) i den mogna efter inledande TCR signal interna är ännu inte helt klarlagt.
Såsom cytoskelettet tros hjälpa två processer kopplade till TCR-aktivering (förflyttning av molekyler vid plasmamembranet och kontrollen av signalmolekyler som är beroende av aktincytoskelettet 3,4), att förstå hur cytoskelettet omarrangerar spatialt och temporalt kommer belysa stegen molekyl omorganisation under synaps bildning. Bakåtsträvande flöde av F-aktin tros Corral TCR kluster mot mitten av den immunologiska synapsen, är denna translokation tros vara avgörande för signal upphörande och återvinning; medhjälp den fina balansen av T-cellsaktivering 5.
Även standard fluorescensmikroskopi är ett flexibelt verktyg som fortsätter att ge insikt om många biologiska händelser, inklusive cell-cell-interaktioner, är den begränsad av systemets förmåga att korrekt lösa flera fluoroforer bor närmare än diffraktionsgräns (≈200 nm) för varandra. Som många molekylära händelser inom celler innebär täta populationer av molekyler och uppvisar dynamisk ombildning antingen i viloläge eller vid specifik stimulering, gör konventionell ljusmikroskopi inte ger en fullständig bild.
Användningen av superupplösning avbildning har tillåtit forskare att kringgå diffraktionsgränsen med användning av en mängd olika tekniker. Enda molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) såsom PALM och STORM 6,7 har förmågan att lösa placeringen av molekyler upp till en precision av omkring 20 nm, men dessa tekniker är beroende av långa hämtningstider, att bygga upp en bild över många ramar . Generellt kräver detta prov för att fastställas eller strukturer för att uppvisa låg rörlighet så enkla fluoroforer inte misstolkas som flera punkter. Medan stimulerad utarmning emission (STED) imaging tillåter super-upplösning genom mycket selektiv konfokal excitation 8, skanning krävstillvägagångssätt kan vara långsam under hela cell synfält. STED visar också betydande fototoxicitet för högre upplösningar på grund av den ökade makt utarmning trålen.
Strukturerad belysning mikroskopi (SIM 9) är ett alternativ till dessa metoder, som kan fördubbla upplösningen av en standardfluorescensmikroskop och är mer förenlig med levande cell imaging än nuvarande SMLM tekniker. Den använder lägre lasereffekter, i ett system brett fält för hela celler synfält; ger ökad förvärvs hastigheter, och är kompatibel med standard fluoroforen märkning. Den brett fält natur SIM medger också användningen av total intern reflektion fluorescens (TIRF) för mycket selektiva excitering, med inträngningsdjup i den axiella dimensionen av <100 nm.
Bildkorrelationsspektroskopi (ICS) är en metod för att korrelera variationer i fluorescensintensitet. En utveckling av ICS; Spatiotemporala imålder korrelationsspektroskopi (STICS 10) korrelerar intracellulära fluorescerande signaler i tid och rum. Genom att korrelera pixelintensiteter med omgivande pixlar i eftersläpande bilder via en korrelationsfunktion, är information de fått om flödeshastigheter och rikt. För att säkerställa statiska objekt inte stör den STICS analysen en orörlig objektfilter implementerat, som fungerar genom att subtrahera ett rörligt medelvärde av intensitetpixel.
Tekniken presenteras här tros vara den första demonstrationen av bildkorrelationsspektroskopi appliceras på super upplösning mikroskopi data för att kvantifiera den molekylära flödet i levande celler 11. Denna metod förbättrar diffraktionsbegränsade avbildning av F-aktin flöde via STICS analys 12 och skulle passa forskare som vill bestämma tvådimensionell molekylär flöde i levande celler, från data som förvärvats på rumsliga upplösningar bortom diffraktionsgränsen av ljus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna teknik gör det möjligt för forskare att bilden och kvantifiera tidigare olösliga detaljer i celler som uttrycker fluorescens. I våra resultat visar vi att F-aktin flöden på ett symmetriskt sätt från cellperiferin mot cellens centrum i T-cellen IS. Dessa resultat överensstämmer med tidigare resultat från 1D linjeprofil kymograph uppgifter 13 och utöka kapaciteten för analys till 2D och super-upplösning uppgifter.
Den presenterade tekniken är en progression fr?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
Referências
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
