Epikardiell utvekst Kultur-analysen og<em> Ex Vivo</em> Vurdering av Epikardial-avledet celle migrasjon
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
Et enkelt lag av epikardiale cellelinjer hjertet, og gir parakrine faktorer som stimulerer proliferasjon kardiomyocytt og bidrar direkte kardiovaskulære progenitorer i løpet av utvikling og sykdom. Selv om en rekke faktorer har vært implisert i epikardet-avledede celle (EPDC) mobilisering, blir de mekanismer som styrer deres etterfølgende migrering og differensiering dårlig forstått. Her presenterer vi in vitro og ex vivo strategier for å studere EPDC motilitet og differensiering. Først beskriver vi en fremgangsmåte for å oppnå primær epikardiale celler ved å utvekst kultur fra den embryoniske mus hjerte. Vi introduserer også en detaljert protokoll for å vurdere tredimensjonal migrering av merket EPDC i et organkultursystemet. Vi gir bevis ved hjelp av disse teknikkene som genetisk sletting av myocardin relaterte transkripsjonsfaktorer i epikardet demper EPDC migrasjon. Denne tilnærmingen fungerer som en plattform for å vurdere kandidatens modifikatorer av EPDCbiologi og kan brukes til å utvikle genetiske eller kjemiske skjermer for å identifisere nye regulatorer av EPDC mobilisering som kan være nyttig for hjerte reparasjon.
Introduction
Epikardet er et enkelt lag av mesothelial celler som linjer hjertet og påvirker hjerte utvikling, modning og reparasjon. Gjennom et høyt koordinert utveksling av parakrine signaler, er den intime dialog mellom hjertemuskelen og epikardet uunnværlig for hjerte vekst og dannelse av ikke-kardiale myocyte linjene 1. Epikardiale-avledede celler (EPDC) komme ut av en undergruppe av epikardiale cellene gjennom et epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) 2, invadere subepicardial plass og underliggende myokard, og differensiere i stor grad inn i koronare vaskulære vegg celler og hjerte fibroblaster, og til en mindre grad, endotelceller og kardiomyocytter 3-9.
Mekanismene som regulerer epikardiell EMT og EPDC invasjonen har blitt tilskrevet den koordinert aksjon fra ulike molekyler inkludert utskilles ligander 10-13, reseptorer på celleoverflaten og adhesjonsmolekyler 14,15, bestemmelser ogspekulantene av apikal-basal polaritet 16,17, små GTPases 18,19, og transkripsjon faktorer 2,20,21. Mens mange av de molekylære effektorer av EPDC migrasjon er definert, til en bedre forståelse av de fysiologiske signaler som stimulerer EPDC mobilisering i embryoet kan akselerere utviklingen av strategier manipulere denne prosessen i den voksne for bedre hjerte reparasjon.
Studier som tar sikte på å identifisere nye regulatorer av EPDC mobilisering stole på rensing av denne cellepopulasjon eller hvem som er migrasjon av individuelle epikardiale celler. En eller en kombinasjon av markørgener, inkludert WT1, Tcf21, Tbx18, og / eller Aldh1a2, er ofte brukt for å identifisere fosterets epikardet en. Imidlertid er anvendelse av disse markørene spor trekkende EPDC er ikke optimalt som uttrykk for epikardiale markører avtar i løpet av hjerte utvikling og går ofte tapt når epikardiale cellene gjennomgå transdifferentiation inn mesenchymalceller.
Anvendelsen av Cre / loxP system, i forbindelse med avstamning-tracing journalister, har vært nyttig i permanent merking av epikardet og dens etterkommere under hjerte utvikling og etter iskemisk skade i voksen 7,22,23. Flere epikardiale-restricted Cre linjer har blitt generert, og er mye brukt til å merke EPDC og for betinget genet sletting strategier 1. Disse studiene har ført til karakterisering av ulike epikardiale linjene, og identifisering av kritiske mediatorer av EPDC motilitet og differensiering. Men, samler bevis tyder også epikardet er en heterogen populasjon av stamceller 4,24,25. Således vil bare en undergruppe av celler epikardiale være målrettet anvendelse av en gitt Cre driver.
For å merke hele epikardet uansett Cre spesifisitet, har en rekke laboratorier benyttet utvekst Culdige systemer eller ex vivo orgel kultur metoder for å trofast isolere eller merke epikardiale celler uten avhengig uttrykk for en genetisk avstamning markører 26-28. For ex vivo migrasjon studier, er embryonale hjerter isolert før epikardiell EMT og dyrket i medium supplert med et grønt fluorescerende protein (GFP) -expressing adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Denne tilnærmingen muliggjør effektiv merking av hele epikardet i stedet for en undergruppe av celler ved Cre-formidlet rekombinasjon. Hjerte kulturer senere blir utsatt for kjente indusere av EMT å stimulere mobilisering av EPDC 28,29. Ex vivo og in vivo analyser er supplert med in vitro epikardiale eksplantering kulturer, som er et spesielt nyttig tilnærming for å utforske detaljerte mekanismer som driver EPDC migrasjon.
Her beskriver vi metoder for å isolere primær epikardiale celler for in vitro studier av epicardial EMT, samt et organ kultursystem for ex vivo-analyser av EPDC motilitet. Vi har nylig demonstrert nytten og robusthet av denne metoden ved genetisk modulere myocardin relaterte transkripsjonsfaktor (MRTF) / serum responsfaktor (SRF) signal- aksen å manipulere aktin basert migrasjon av EPDC 9. Mens våre funn markere en signalveien er nødvendig for å regulere EPDC migrasjon, disse metodene er egnet for å rakne mekanismene som kollektivt orkestrere EPDC migrasjon og differensiering. Videre kan eksplantering og ex vivo kultur systemer implementeres i funksjonelle skjermer for å identifisere nye regulatorer av EPDC mobilisering for terapeutiske anvendelser i hjerte gjenfødelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her skisserer vi detaljerte metoder for å isolere primær epikardiell celle ved utvekst og spore EPDC migrasjon i ex vivo hjerte kulturer. For utvekst kulturer, den passende tid til å fjerne den epikardet fattige hjerte varierer noe mellom eksperimenter. Periodisk overvåkning av eksplantater etter en inkubasjon over natten anbefales for å måle omfanget av epikardiell utvekst og for å trekke ut hjertet før fibroblaster vises. For å sikre renhet, bør hjerter fjernes innen 24 timer fra eksplanteres å hin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) [tilskuddet antallet R01HL120919]; American Heart Association [tilskuddet antallet 10SDG4350046]; University of Rochester CTSA pris fra NIH [tilskuddet antallet UL1 TR000042]; og oppstart midler fra Aab CVRI. MAT ble støttet delvis av et stipend til University of Rochester School of Medicine og odontologi fra Howard Hughes Medical Institute Med-Into-Grad Initiative; og en institusjonell Ruth L. Kirschstein National Research Service Award fra NIH [tilskuddet antallet GM068411].
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
Referências
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
