ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus
Summary
כאן אנחנו מעסיקים מתודולוגיה FISH לעקוב ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת הגרעינים היחידה בפערי כרומוזום של שורות תאי HepG2 להביע LINE-1 הסינטטי ביציבות.
Abstract
Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5′ truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.
Introduction
אדם הארוך וביניהם גרעיני Element-1 (קו-1 או L1) הוא מרכיב נייד אוטונומי, המתקדם בתוך הגנום באמצעות "העתק ודבק" מנגנון ורטרו-טרנספוזיציה. L1 אדם טיפוסי הוא ~ 6 kb ארוך ומורכב 5'UTR (אזור מתורגם) המשמש כמקדם, שתי מסגרות קריאה פתוחות (ORFs): L1 -ORF1 ו L1 -ORF2, וכן 3'UTR עם פולה יש זנב L1 חלבון -ORF1 שלושה תחומים נפרדים:. תחום סליל סליל, RNA הכרת Motif ו- C- מסוף תחום, בעוד חלבון L1 -ORF2 יש endonuclease, הפוך transcriptase ותחומים עשירים ציסטאין 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 מפגין פעילות המלווה חומצות גרעין, בעוד L1 -ORF2 מספק פעילות אנזימטית, עם שני החלבונים הדרושים עבור ורטרו-טרנספוזיציה 1,2,6.
מחזור של L1 ורטרו-טרנספוזיציה מתחיל עם תעתיק מן 5'UTR של L1 </em> mRNA bicistronic ידי RNA פולימראז II, טרנסלוקציה לתוך הציטופלסמה, ותרגום. בציטופלסמה, מיצגים L1 -ORF1 או ציס -binding בו חבילות RNA משלה או -binding טרנס בו חבילות RNAs אחרים (כלומר, סינוס / SVAs / פסוידו) כדי ליצור חלקיק ribonucleoprotein (RNP) עם L1 -ORF2p 7, 8. RNPs translocate לתוך הגרעין שבו פעילות endonuclease של ניקס L1 -ORF2p הדנ"א הגנומי (gDNA) כדי לחשוף את OH – קבוצה 9, כי הוא בתורו שמוצג טרנסקריפטאז הפוך הממשלה הפוכה לסנתז RNA ל- DNA מסוף '3. במהלך סינתזה הפוכה, הגדיל השני של ה- DNA הוא פצע 7-20 נ"ב מאתר ניק המקורי כדי ליצור הפסקות מעד אשר מלאות ליצירת רצפי כניסת L1 החתימה (למשל, TTTTAA) בשם כפילויות אתר היעד (TSD) 9,10. תהליך זה ידוע בשם שעתוק לאחור ממשלת היעד (TPRT) ומוביל insertiעל של עותקים מלאים או קטועה של DNAs L1 / אחרים עם TSDs בשני קצותיו של רצף מוכנס. ורטרו-טרנספוזיציה L1 הוכח גם להיות מתווכת דרך הקצה שהצטרף שאינם הומולוגיים TPRT דמוי בסוגי תאים מסוימים 11.
וקטור ורטרו-טרנספוזיציה L1 המועסקים המחקרים שלנו הוא בלתי episomal והוא מורכב מתויג L1 -ORF1 & מונע 2p ידי היזמים CMV-L1-5'UTR משולב (איור 1) 12. גרסאות מוקדמות יותר של מבנה זה תוארו במחקרים באמצעות שמרים תרביות תאים אנושיים 13,14,15. שני היזמים CMV ברורים הממוקם 5 'ו 3' מסתיים של וקטור, עם הסוף '3 להציב אוריינטציה הפוכה לנהוג ביטוי של neomycin לאחר שחבור ואינטגרציה. הקלטת מחוון ורטרו-טרנספוזיציה בסוף '3 מורכב antisense מוכנס גנים neomycin כדי L1 -ORFs ויהפכו פעיל על ידי הפרדה לשני חצאים על ידי גושב אינטרון עם תורם שחבור (SD) ו acceptor שחבור (SA) אתרים (איור 1). עם האינטגרציה לתוך כרומוזום, L1 הוא עבד מן האמרגן המשותף לייצר mRNA שמורכבת mRNA bicistronic ו mRNA neomycin הפעיל. במהלך עיבוד RNA, האינטרון גלובין עובר שחבור מתוך הגן neomycin לשחזר גן neomycin מתפקדת במלואה. ה- mRNA ההיברידית ארוזה לתוך RNP ב CIS ו translocated לתוך הגרעין שם הוא משולב לתוך הגנום גם בתור הוספות באורך מלא או קטומים באמצעות TPRT.
כאן אנו מתארים מתודולוגיה המשתמשת קרינת כלאה באתרו (FISH) עם בדיקות המכוונות באופן ספציפי על גן neomycin השחבור (SNeo) כדי לעקוב אחר דפוסי L1 -retrotransposiition ושיעורי כניסה ברמת הגרעין היחידה. היעיל והספציפי של זיהוי אושר באמצעות ורטרו-טרנספוזיציה מוסמכת ובונה חסרה ו חלליות Detect SNeo או neomycin ו גלובין אינטרון צומת 16. מתודולוגיה זו מהווה חלק מן החסרונות של מבחנים ורטרו-טרנספוזיציה מבוססת תרבית תאים, כגון הוספות מרובות, התנגדות מושבה והרחבת שיבוט חיובית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתודולוגיות כמו רצף הגנום כולו, הפוך PCR סופג דרומי הועסקה ללמוד ורטרו-טרנספוזיציה L1. למרות מתודולוגיות אלה הן בעלי ערך רב באיתור שבו הוספות L1 להתרחש בתוך הגנום, אתגר מבלבל עבור כל אחד מהם הוא הצורך תיכנות ב-סיליקון לצרף יחד רצפים. המתודולוגיה FISH המתואר כ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 and ES017274) and AstraZeneca to KSR.
Materials
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10X colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparing chromosome Spreads. | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/mL |
| 1M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1mg/mL of Rnase A | Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount | ||
| Detection Buffer | Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. |
Referências
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
- Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
- Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
- Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
- Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
- Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
- Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
- Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
- Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
- Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
- Bojang, P., Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
- Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
- Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
- Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
- Bojang, P., Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
- Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
- Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
- Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
- Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
- Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
- McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
- Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
- Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).
