افضل طريقة لرابيد تنبيب القصبة الهوائية في الفئران
Summary
تقدم هذه المقالة طريقة سريعة وبسيطة لإدارة بليوميسين مباشرة إلى القصبة الهوائية الماوس عبر التنبيب. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تكرار للغاية، وسهلة لسيده، ولا يتطلب معدات متخصصة أو أوقات الانتعاش طويلة.
Abstract
Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.
Introduction
على الرغم من بعض الاختلافات التشريحية والفسيولوجية، تستمر 1 نماذج الفئران أنها لا تقدر بثمن لنمذجة البيولوجيا البشرية والتسبب بالمرض. 2 من وجهة نظر لتربية والفئران من السهل التعامل معها، ويكون وقتا تربية منخفضة، والعمر المتوقع تسارع، وغير مكلفة نسبيا الى المنزل. مع تطور سلالات متنوعة الوراثية واستراتيجيات (على سبيل المثال، مشروطة تدق الرافضة والفئران مراسل والنهج تتبع النسب، وما إلى ذلك)، فضلا عن مجموعة واسعة من الكواشف المتاحة (على سبيل المثال، الأجسام المضادة، والبروتينات المؤتلف، مثبطات، وما إلى ذلك)، أصبحت الفئران والضروري نموذج الفقاريات كائن لكشف عمليات التوازن وأمراض الإنسان. 3
وكانت الفئران ذات قيمة خاصة لدراسة أوضاع الرئوية، بما في ذلك الإصابات الحادة الرئة (علي) والتليف الرئوي. 4 ALI في البشر يمكن أن تكون ناجمة عن الصدمة أو الإصابة، أو تعفن الدم ويتميز الظهارية وتسرب البطانية (أي، وذمة)، والتهاب، والتليف الوليدة. في كثير من المرضى، ALI يتقدم لفي شكل حاد، متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)، والذي غالبا ما يؤدي إلى تليف وفاة بسبب فشل في الجهاز التنفسي. 5،6 التليف الرئوي هو تقدمي، علم الأمراض القاتلة والتي تتميز ترسب الزائد من المصفوفة خارج الخلية ، وأبرزها النوع الأول من الكولاجين، مما يؤدي إلى عرقلة وظيفة الرئة. 7،8 إدارة بليوميسين (بلم) هو النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع وأفضل وصف لإحداث ALI وتليف في حيوانات التجارب. 9 وعلى الرغم من بلم الناجم عن التليف الرئوي في القوارض يفعل لا ألخص تماما الظواهر التليفية الإنسان، أدت 10 دراسات الفأر مع هذا النموذج إلى اكتشاف العديد من العوامل الهامة التي تؤثر على ظهور وتطور المرض. 11
في حين أن الآلية الدقيقة (ق) وراء تكون الألياف التي يسببها بلم غير معروفة، وإصابة بدءويعتقد أن تنشأ من فواصل حبلا الحمض النووي التي تعتمد على الاتصال في الخلايا الظهارية المبطنة الشعب الهوائية التي تقوم بتنفيذ أو الحويصلات الهوائية، وعلى وجه الخصوص، نوع 1 pneumocytes 12 الحاجة للاتصال المباشر بين بلم والظهارة الرئوية يسلط الضوء على أهمية وجود مسار تسليم قوي وهذه المخاوف هي أيضا ثيق لمجموعة واسعة من العلاجات التي تستهدف الشعب الهوائية البعيدة، بما في ذلك البروتينات المؤتلف، والأجسام المضادة، سيرنا، الفيروسات، البكتيريا، والجسيمات، وأكثر من ذلك. طموح الفم والبلعوم (OPA) وقد استخدم على نطاق واسع لهذا الغرض 13، ولكن أحد أوجه القصور الرئيسية من التلوث النفطي هو جزء من وكيل تسليمها قد ابتلع في الجهاز الهضمي، مما يؤدي إلى عدم الدقة في الجرعة. مقاربة أخرى تستخدم على نطاق واسع هو تقطير عبر الرغامى، الذي ينطوي على القصبة الهوائية تحت التخدير قوية لفضح القصبة الهوائية وتقطير وكيل مباشرة في الجهاز التنفسي. 14 ومع ذلك، لا يجوز هذا فقطإجراء يكون غير مرغوب فيه بسبب invasivity لها، ولكنها أيضا وقتا طويلا، ويتطلب عادلة قليلا من التدريب، ويؤدي إلى إصابة قوية في الجهاز التنفسي وقد وضعت. 15،16 العديد من البروتوكولات التي تنطوي على الإدارة المباشرة للعملاء في القصبة الهوائية دون الحاجة للتدخل الجراحي، 16،17،18،19،20 أوقات الانتعاش ولكن هذه الطرق تتضمن تمديد الناجمة عن التخدير قوية، واستخدام معدات باهظة الثمن (أي، منظار الأذن / المنظار، لوحات إجراء المتاحة تجاريا، بالألياف البصرية الأسلاك، وما إلى ذلك)، وجود فائض من التلاعب في تجويف الفم، وعدم اليقين بشأن الجرعة.
توضح هذه الورقة طريقة سهلة نسبيا للإدارة عبر التنبيب التي تسمح للباحث بسرعة، غير مكلفة، وغرس موثوق كاشف في الرئة الفئران مع خطر محدود من الضرر المتبقية إلى الأنسجة المحيطة بها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الحالات التي تكون فيها هباء غير عملي نظرا لمحدودية كاشف، والسلامة، أو التكلفة، والإدارة القصبة الهوائية المباشرة هي طريقة مثلى لإيصال عوامل دخيلة إلى الرئتين عبر الرغامى 16 تقطير وقد استخدم على نطاق واسع لتحقيق ذلك؛ ومع ذلك، كما هو الحال مع كل تدخل جراحي، فإ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر براين جونسون علم الأنسجة والتصوير الأساسية في جامعة واشنطن للمساعدة في تلطيخ ثلاثي الألوان والتحليل. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL098067 وHL089455.
Materials
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | N/A | N/A | |
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2ml Pipettor and Filter Tips | N/A | N/A | |
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | N/A | N/A | See Diagram 1. |
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | N/A | N/A | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | N/A | http://www.highlandmedical.net/ |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
Referências
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?. Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis – preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. d. R., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. d. S. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601 (2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261 (2014).
