Усовершенствованный метод Rapid интубации трахеи у мышей
Summary
Данная статья представляет собой быстрый и простой способ введения блеомицин непосредственно в трахею мыши с помощью интубации. Основные преимущества этого метода является то, что это очень воспроизводимые, легко освоить, и не требует специального оборудования или длительных сроков восстановления.
Abstract
Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.
Introduction
Несмотря на некоторые анатомо-физиологические различия, 1 модели мышиных оставаться бесценным для моделирования биологии человека и патогенеза заболевания. 2 С животноводства точки зрения, мышей легки в обращении, имеют низкое время размножения, ускоренный срок, и относительно недороги в дом. С развитием различных генетических штаммов и стратегий (например., Условные нокауты, корреспондент мышей, клона трассировки подходов и т.д.), а также широкий диапазон доступных реагентов (например., Антитела, рекомбинантные белки, ингибиторы, и т.д.), мышей стали неотъемлемой модель позвоночных организм раскрыть гомеостаза и болезненных процессов человека. 3
Мыши были особенно ценны для изучения легочных заболеваний, в том числе острого повреждения легких (ALI) и фиброза легких. 4 ALI у человека может быть вызвана травмой, травмы или сепсиса и характеризуется эпителиальной иэндотелиальных утечки (т.е.., отек), воспаление и фиброз возникающий. У многих пациентов, ALI прогрессирует до тяжелой форме, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), что часто приводит к фиброзу и смерти из-за дыхательной недостаточности. 5,6 Пневмосклероз является прогрессивным, фатальным патология характеризуется избыточным отложением внеклеточного матрикса , особенно типа коллагена, что приводит к нарушению функции легких. 7,8 администрацию блеомицин (BLM) является наиболее широко используемым и наиболее хорошо охарактеризованных модель для индукции ALI и фиброз у подопытных животных. 9 Хотя BLM-индуцированной легочный фиброз у грызунов делает не повторять полностью на фиброзные фенотипы человека, 10 исследований на мышах с этой моделью привели к открытию многих важных факторов, влияющих на возникновение и прогрессирование болезни. 11
Хотя точный механизм (ы) позади BLM-индуцированной фиброгенеза неизвестны, инициирующий травмыСчитается, что возникают из контакт-зависимые перерывов нитей ДНК в эпителиальных клетках, выстилающих проводящие дыхательные пути и альвеолы и, в частности, тип 1 пневмоцитами. 12 Необходимость прямого контакта между BLM и легочный эпителий подчеркивает важность надежной маршруту доставки , и эти проблемы также уместны в широком диапазоне процедур адресованный дистальных дыхательных путей, в том числе рекомбинантных белков, антител, миРНК, вирус, бактерии, частицы, и больше. Орофарингеального аспирации (ОРА) широко используются для этой цели 13, но основным недостатком ОРА является то, что часть поставленного агента может быть проглочена в желудочно-кишечном тракте, тем самым приводя к неточности в введенной дозы. Другой широко применяемый подход транстрахеальная закапывания, который включает в себя трахеостомии под сильным наркозом подвергать трахеи и инстилляцию агента непосредственно в дыхательные пути. 14 Тем не менее, не только может, напримерпроцедура нежелательно из-за его invasivity, но это также много времени, требует справедливый бит обучения, и вызывает мощную травмы дыхательных путей были разработаны. 15,16 Несколько протоколов, которые связаны с непосредственным управлением агентов в трахеи без необходимости хирургического вмешательства, 16,17,18,19,20, но эти способы включают расширенные сроки восстановления вызвано мощными анестетиками, использование дорогостоящего оборудования (т.е.., отоскоп / ларингоскопическая, коммерчески доступные процедура доски, волоконно-оптические провода и т.д.), избыток манипуляции в полости рта, а также неопределенность в отношении дозировки.
Эта статья описывает относительно простой метод введения через интубации, который позволяет исследователю быстро, недорого и надежно привить реагента в мышиной легкого с ограниченным риском остаточного повреждения окружающих тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В случаях, когда аэрозолизации непрактично из-за ограниченной доступности реагентов, безопасности или стоимости, непосредственное введение трахеи является превосходным способом доставки экзогенных агентов в легкие 16 транстрахеальная закапывания широко используется для дост?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Брайан Джонсон из гистологии и визуализации керн при Университете штата Вашингтон за помощь в окрашивании трихромом и анализа. Эта работа была поддержана NIH гранты HL098067 и HL089455.
Materials
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | N/A | N/A | |
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2ml Pipettor and Filter Tips | N/A | N/A | |
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | N/A | N/A | See Diagram 1. |
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | N/A | N/A | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | N/A | http://www.highlandmedical.net/ |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
Referências
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?. Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis – preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. d. R., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. d. S. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601 (2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261 (2014).
