Isolering af CD146⁺ Resident Lung Mesenchymale stromacellers fra Rotte Lunger

Summary

Denne protokol beskriver en isolation teknik til opnåelse primære lunge residente mesenchymal stromaceller fra rotter, ved brug af enzymatisk fordøjelse, gradient separation massefylde, plast adhærens og CD146 ⁺ magnetiske perler markering.

Abstract

Mesenkymale stromale celler (MSC'er) er i stigende grad anerkendt for deres terapeutiske potentiale i en lang række sygdomme, herunder lungesygdomme. Udover brugen af ​​knoglemarv og navlestrengen MSC for eksogen celleterapi er der også stigende interesse i reparation og regenerativ potentiale hjemmehørende væv MSC. Desuden har de sandsynligvis have en rolle i normal organudvikling, og er blevet tilskrevet roller i sygdom, især dem med en fibrotisk natur. Den vigtigste hindring for studiet af disse residente væv MSC'er er manglen på en klar markør til isolering og identifikation af disse celler. Isoleringen teknikken beskrevet her anvender flere karakteristika lunge residente MSC'er (L-MSC). Efter aflivning af rotterne, er lungerne fjernes og skylles flere gange for at fjerne blod. Efter mekanisk dissociation af skalpel, er lungerne fordøjes i 2-3 timer ved anvendelse af en blanding af kollagenase type I, neutral protease og DNase type I. Den obtained enkelt cellesuspension vaskes efterfølgende og lagt over densitetsgradient medium (densitet 1,073 g / ml). Efter centrifugering er celler fra interfasen vasket og udpladet i kultur-behandlede kolber. Celler dyrkes i 4-7 dage i fysiologisk _5% O2, _5% CO2 betingelser. At nedbryder fibroblaster (CD146 ^-) og for at sikre en befolkning på kun L-MSC'er (CD146 ^+), positiv selektion for CD146 ⁺ celler udføres gennem magnetisk perle markering. Sammenfattende denne procedure pålideligt producerer en population af primær L-MSC'er til yderligere in vitro-undersøgelse og manipulation. På grund af karakteren af ​​protokollen, kan det nemt oversættes til andre eksperimentelle dyremodeller.

Introduction

Mesenkymale stromale celler (MSC'er) er i stigende grad anerkendt for deres terapeutiske potentiale i en lang række sygdomme, herunder lungesygdomme. Udover brugen af ​​knoglemarv og navlestrengen MSC for eksogen celleterapi er der også stigende interesse i reparation og regenerativ potentiale hjemmehørende væv MSC. Under udvikling, herunder i lungerne, mesenchymet er en vigtig kilde til udviklingsmæssige signaler, og bosiddende MSC er en sandsynlig kandidat til at være i centrum af dette. Desuden er beviser opstå, at hjemmehørende MSC forstyrres i voksne sygdomme, herunder cancer ^1,2 og fibrose ^3. Den vigtigste forhindring for studiet af disse hjemmehørende væv MSC er manglen på en klar markør til isolering og identifikation af disse celler ^4. Stamcelle antigen-1 (Sca-1) blev identificeret i mus som en markør for en række væv stamceller, og kan anvendes til isolering af L-MSC'er ^5, men har desværreingen kendt orthologer i andre arter ^6. Forskere har rapporteret om en række forskellige isoleringsmetoder til isolering af L-MSC'er fra enten lungevæv eller væske. Disse varierer fra fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) baserede metoder selektion for CD31 ^– / CD45 ^– / CD90 ⁺ celler ^7, CD31 ^– / CD45 ^– / epitel celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) – / Sca-1 + -celler ^8, multilægemiddelresistens transportør ATP bindende kassette G (ABCG2) positive celler ⁹ eller Hoechst 33342 farvestof udstrømning ^10, til plast tilslutning ^11,12 og migration ud af hakket væv ^13.

Fordelene ved heri præsenterede metode er flere gange. Ved at bruge en blid enzymatisk fordøjelse og densitetsgradient ^14, opnår man alle cellerne i tæthedsområdet der omfatter MSC'er men udelukker epiteliale eller endotelceller. Den efterfølgende plast adhærencetrin sikrer, at kun den mesenchymal celler klæbe og ophold i kultur, fjerne leukocytter. Vigtigst imidlertid CD146 ⁺ selektionstrin muliggør fjernelse af fibroblaster, da disse celler ikke udtrykker CD146. Ekspression af celleadhæsionsmolekyle CD146 er positivt korreleret med multipotency, og er derfor en god markør for at frasortere fibroblaster fra en mesenchymal cellepopulation ^15-19. Dette er en fordel ved at benytte CD90 som en selektionsmarkør, da det ikke kun udtrykkes i MSC'er men også i lipofibroblasts ^5,20. I denne protokol har vi udtrykkeligt valgt en magnetisk perle udvælgelse, da det er blidere på cellerne, og hele proceduren kan udføres under sterile forhold. En anden vigtig fordel ved denne isolation metode frem for udvæksten metode, er at det er relativt hurtig, 6-10 dage i modsætning til en måned eller mere for udvækst metode. Tre til fem dage efter den oprindelige isolering af mesenkymale befolkning er klar til CD146 ⁺ sele Indsatsen; efter yderligere tre til fem dage CD146 ⁺ celler er klar til brug i forsøg, eller kan fryses til senere brug. Den reducerede tid Kulturens forbedrer kvaliteten af cellerne som MSC'er transdifferentiate dybt fibroblaster i langvarig ex vivo kultur ^19. Endelig på grund af arten af ​​protokollen, er det muligt at anvende denne metode på andre arter ved blot at vælge egnede antistoffer, eller endda til andre organsystemer ved at justere valget af fordøjelsesenzymer og inkubationstid.

En detaljeret protokol af denne isolation fremgangsmåde følger nedenfor, og en skematisk oversigt over isoleringen og efterfølgende udvælgelse af CD146 ⁺ subpopulationen er tilvejebragt i figur 1A og 1B henholdsvis. Derudover er detaljer inkluderet for passage, frysning og optøning disse celler.

annonce / 53.782 / 53782fig1.jpg "/>
Figur 1. Skematisk oversigt over isolering af pulmonale mesenkymale celler (A) og efterfølgende CD146 ⁺ celle valg (B) min = minutter.; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre ^2. Ab = sekundært antistof; a-CD146 Ab = primære anti-CD146-antistof; -ve celler = CD146-negative celler; + ve celler = CD146 positive celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af Animal Care udvalg fra University of Ottawa (dyr etik protokol Ohri-1696). Animal pleje blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. 1. Isolering af Lung Mesenchymale stromacellers Forbered enzymet mix i en 50 ml rør: vejer 30 U Neutral Protease, 2500 U Collagenase I og 500 U DNAse I. Disse beløb er tilstrækkelige til lungerne af en voksen mus eller rotte hvalp. Forbered på dag af isolation og opbevares ved 4 ° C indt…

Representative Results

To af de mest pålidelige fysiske egenskaber for MSC, tæthed og plast vedhæftning, der bruges i den første del af denne protokol til at opnå den mesenkymale cellefraktion af lungen, der indeholder L-MSC'er. Selvom densitetsgradient interfase vil omfatte monocytter og makrofager foruden lunge mesenchymal-celler, plast vedhæftning efterfulgt af 3-5 dages dyrkning sikre at det kun lungen mesenkymale celler forbliver. Faktisk denne celle population udtrykker de klassiske MSC overfla…

Discussion

Den isolering og dyrkning af primære L-MSC'er giver mulighed for bedre at forstå deres funktion og samspil med andre cellepopulationer på celleniveau, og deres rolle i lunge udvikling, sundhed og sygdom. Dette er især vigtigt da manglen på en specifik enkelt markør for disse celler gør det næsten umuligt at studere disse celler in situ. Som med alle primære cellepopulationer, bør man huske på, at disse celler er mere tilbøjelige til at ændre deres karakter jo længere de holdes i kultur ^19…

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC