Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl.
Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Darüber hinaus haben sie wahrscheinlich eine Rolle bei der normalen Organentwicklung und haben Rollen in Krankheit zugeschrieben worden, insbesondere solche mit einer fibrotischen Natur. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen. Die Isolierung hier beschriebene Technik gilt mehrere Merkmale von Lungen ansässig MSCs (L-MSCs). Nach Opfer der Ratten, sind Lunge entfernt und mehrmals gewaschen, um Blut zu entfernen. Folgende mechanische Dissoziation von Skalpell werden die Lungen für 2-3 Stunden mit einer Mischung aus Collagenase Typ I, neutrale Protease und DNase Typ I. Die obtaine verdautd Einzelzellsuspension wird anschließend gewaschen und überlagert über Dichtegradienten-Medium (Dichte 1,073 g / ml). Nach der Zentrifugation werden die Zellen aus der Zwischenphase gewaschen und in Kulturflaschen behandelt plattiert. Die Zellen werden für 4-7 Tage in physiologischer 5% O 2, 5% CO 2 Bedingungen. Zu verarmen Fibroblasten (CD146 -) und eine Bevölkerung von nur L-MSCs (CD146 +), die positive Selektion für CD146 + Zellen gewährleistet ist, durch magnetische Perle Auswahl durchgeführt. Zusammenfassend ergibt dieses Verfahren zuverlässig eine Bevölkerung von Primär L-MSCs für weitere in vitro-Studie und Manipulation. Aufgrund der Natur des Protokolls kann es leicht zu anderen experimentellen Tiermodellen übersetzt werden.
Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Während der Entwicklung, unter anderem in der Lunge ist das Mesenchym eine wichtige Quelle für Entwicklungsanzeichen und Bewohner MSCs sind ein aussichtsreicher Kandidat in der Mitte davon zu sein. Darüber hinaus wird immer mehr Anzeichen dafür, dass die Bewohner MSCs bei erwachsenen Krankheiten gestört werden, einschließlich Krebs 1,2 und Fibrose 3. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen 4. Stammzell-Antigen-1 (Sca-1) wurde in Mäusen als Marker für eine Vielzahl von Gewebestammzellen identifiziert und können für die Isolierung von L-MSCs 5 verwendet werden, hat aber leider6 Orthologe in anderen Spezies nicht bekannt. Forscher haben eine Vielzahl von verschiedenen Isolationsverfahren für die Isolierung von L-MSCs entweder von Lungengewebe oder Flüssigkeit berichtet. Diese reichen von Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) basierte Verfahren für CD31 Auswahl – / CD45 – / CD90 + Zellen 7, CD31 – / CD45 – / epithelialen Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) – / Sca-1 + Zellen 8, Multidrug-Resistenz-Transporter ATP-Bindungskassette G (ABCG2) positive Zellen 9 oder Hoechst 33342 Farbstoff Auslauf 10, Kunststoffadhärenz 11,12 und Migration von zerkleinerten Gewebes 13.
Die Vorteile der hier vorgestellten Verfahren sind mehrfach. Durch die Verwendung von 14 eine sanfte enzymatische Verdauung und Dichtegradienten erhält man alle Zellen des Dichtebereichs, die MSCs gehören, epithelialen oder endothelialen Zellen auszuschließen. Die anschließende Kunststoffadhärenz Schritt stellt sicher, dass nur die mesenchymal Zellen anhaften und in der Kultur bleiben, Leukozyten zu beseitigen. Vor allem aber erlaubt die CD146 + Selektionsschritt zur Beseitigung von Fibroblasten, da diese Zellen nicht CD146 exprimieren. Die Expression des Zelladhäsionsmolekül CD146 positiv mit Multipotenz korreliert, und ist daher eine gute Markierung Fibroblasten aus einer mesenchymalen Zellpopulation 15-19 auszusondern. Dies ist ein Vorteil gegenüber CD90 als Selektionsmarker verwendet, da sie nicht nur in MSCs exprimiert wird, sondern auch in lipofibroblasts 5,20. In diesem Protokoll haben wir ausdrücklich ein magnetisches bead Auswahl gewählt, da es auf die Zellen sanfter ist, und die gesamte Prozedur kann unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Isolierungsverfahren wie zum Auswachsen Verfahren gegenüber, ist, dass es relativ schnell ist, als 6-10 Tage bis zu einem Monat oder mehr für den Auswuchs Verfahren gegenüber. Drei bis fünf Tage nach der ersten Isolierung der mesenchymalen Bevölkerung ist bereit für CD146 + Sele ction; Nach weiteren drei bis fünf Tagen die CD146 + Zellen sind bereit für Experimente verwendet werden oder kann für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Die verringerte Zeit der Kultur verbessert die Qualität der Zellen als MSCs transdifferentiate Richtung Fibroblasten in Kultur verlängert ex vivo 19. Schließlich wegen der Art des Protokolls ist es möglich, dieses Verfahren auf andere Arten anzuwenden, indem einfach geeignete Antikörper oder sogar auf andere Organsysteme Auswahl durch die Wahl der Verdauungsenzyme und Inkubationszeit eingestellt wird.
Ein detailliertes Protokoll dieser Isolierungsmethode ist unten angegeben, und eine schematische Übersicht über die Isolierung und anschließende Auswahl der CD146 + Subpopulation ist in 1A und 1B vorgesehen. Zusätzlich werden Details für die Passage enthalten, Einfrieren und diese Zellen aufgetaut.
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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Isolierung von Lungen mesenchymalen Zellen (A) und die anschließende CD146 + Zellauswahl (B) min = Minuten. EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; 2. Ab = Sekundärantikörpers; a-CD146 Ab = primäre anti-CD146-Antikörper; & ndash; ve Zellen = CD146-negativen Zellen; + ve Zellen = CD146-positiven Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Isolierung und Kultur von Primär L-MSCs stellt eine Chance zu einer besseren ihre Funktion und ihre Wechselwirkung mit anderen Zellpopulationen auf zellulärer Ebene zu verstehen und ihre Rolle in der Lungenentwicklung, Gesundheit und Krankheit. Dies ist besonders wichtig, da der Mangel an einem bestimmten einzigen Markierung dieser Zellen macht es nahezu unmöglich, diese Zellen in situ zu untersuchen. Wie bei allen primären Zellpopulationen, sollte man im Hinterkopf behalten, dass diese Zellen eher auf …
The authors have nothing to disclose.
JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation – Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children’s Hospital of Eastern Ontario Research Institute.
Neutral Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
Pentobarbital sodium (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland | – | Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more. |
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose | Life Technologies | 14287-072 | Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion |
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC. |
αMEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Warm in 37oC water bath before use |
200 mM L-Glutamine | Life Technologies | 25030-164 | |
100x Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | Penicillin/Streptomycin/Fungizone |
M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Magnetic beads |
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below |
DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice. |
TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE |
anti-rat CD146 antibody | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12.5 μl per 0.5 x 106 cells |
Pentaspan (pentastarch solution) | Bristol-Myers Squibb Canada | – | Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl. |
Mr.Frosty freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC |