Den CRISPR / Cas9 system tilbyder potentialet til at gøre målrettet genom redigering tilgængelige og overkommelige for det videnskabelige samfund. Denne protokol er beregnet til at vise, hvordan man kan skabe virus, der vil knockout et gen af interesse ved hjælp af CRISPR / Cas9 system og derefter injicere dem stereotaksisk i den voksne mus hjernen.
Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism’s genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.
For at undersøge grundlaget for normal fysiologi og patologi, der er behov for præcist at manipulere genekspression i modelorganismer. For pattedyr modelorganismer, er denne stort set centreret om etablering og udvikling af transgene mus, hvor et genetisk element af interesse er flankeret af lokaliteter, der er anerkendt af en rekombinase. Dette kan resultere i en stedsspecifik manipulation af disse flankerede gener. Mens dette har været en vellykket strategi, er det tid og ressourcekrævende; for eksempel skabe en tredobbelt transgent dyr, der ville udtrykke et floxed gen, Cre-rekombinase, og en Cre reportergen kræver flere parringer og validering. I modsætning hertil stereotaktisk injektion af replikationsdefekte virale partikler der koder for et fluorescerende protein og rekombinasen i en floxed gen dyr ikke kræver kompliceret genotypebestemmelse eller avlsstrategier 1. Yderligere, hvis et fluorescerende protein og Cre udtrykkende virus er co-injiceret med en anden virus encoding en anden fluorescerende protein, så dette giver en indenfor-vævskontrol til målrettet genetisk manipulation. Mens denne strategi stadig kræver anvendelse af knock-in dyr, viralt medierede RNA baserede strategier omgå behovet for transgene dyr. For eksempel kan stereotaktisk injektion af replikationsdefekte vira, der koder for et fluorescerende protein og en kort hårnål RNA (shRNA) anvender cellens endogene RNAi maskiner til at resultere i en potent reduktion af transskriptionen af et gen af interesse. Men shRNA strategier producerer subtile gen knock-downs ofte resulterer i beskedne cellulære fænotyper 2. Mens en knock-down kan være mere fysiologisk relevant for heterozygot gen dysfunktion, dens nedsat robusthed i forhold til en knock-out er ikke ideel til fænotypisk opdagelse af nye gener.
En tredje teknik, der har for nylig vist, CRISPR (Grupperet Regelmæssigt indbyrdes afstand Short palindrome Repeat) / Cas9 (CRISPR-associeredeprotein 9) systemet, er afhængig af ekspression af både en lille eksogene RNA og et DNA-skæring enzym. CRISPR / Cas9 systemet blev tilpasset fra den prokaryote immunsystemet, som udviklede en fremgangsmåde til identifikation fremmed, invaderende DNA fra virus og målrette den til nedbrydning via Cas9 enzymet 3,4. Denne kraftfulde genom redigering teknik kan bruges til at skabe målrettede deletioner, insertioner og mutationer; og følgende protokol vil skitsere, hvordan man laver sletninger i et gen af interesse for at knockout udtryk i vivo. Den Cas9 enzym skal udtrykkes med en guide RNA homolog til regionen af interesse og sammenhængende med et stillads RNA. Knockout af et gen ved hjælp af denne teknik kræver målretning Cas9 til en specifik region i genomet under anvendelse af syntetiske guide RNA'er (sgRNA), og inducere dobbeltstrengede pauser (DSBs) på et sted af interesse. Disse DSBs derefter repareret af den endogene celle-reparation maskiner via ikke-homologe ende-sammenføjning (NHEJ), som leannonce til indels der kan producere missense eller nonsense mutationer og kan derfor skabe et tab af funktionelt protein-ekspression 5. Da dette system producerer genomiske forandringer, det kræver kun forbigående udtryk for Cas9 og sgRNA. Det er dog ønskeligt, at en stabil fluorescensindikator at identificere celler og deres afkom manipuleret på denne måde.
Lenti- og retrovira har den fordel af stabilt integrere DNA af interesse i værtsceller, som opretholder langvarig ekspression og er gået ned til datterceller under mitosen. Denne protokol beskriver design og produktion af to typer replikation defekt, høj titer retrovirus: human immundefekt virus afledte lentivirale partikler (lentivirus) og de er baseret på murine Maloney leukæmi virus (retrovirus). Mens begge disse vira er i stand til at understøtte stabil ekspression af store transgener, kan de retrovirale partikler kun integrere i genomet during celledeling med nedbrydningen af det nukleare kuvert, og derfor kan bruges som et redskab til at mærke og fødsel-date celler 6. Mens lentivirus har ry for at være relativt lav titer 7, denne metode, herunder brug af koffein 8 under viral samling, rutinemæssigt producerer titere af 10 9 og 10 10 partikler / ml. En anden fordel ved lenti- og retrovira er tolerancen for meget store inserts. Følgende samling af protokoller skitserer proceduren for at designe en Lenti eller retrovirus koder for en fluorescerende reporter, sgRNAs, og Cas9 at udnytte CRISPR / Cas9 system til at modificere DNA samt udtrykke et fluorescerende protein.
Mus stereotaktisk neurokirurgi er en værdifuld metode til at injicere virus in vivo for at studere morfologi, funktion, og tilslutning af inficerede neuroner. Viral infektion i neuroner kan anvendes til at manipulere ekspressionsniveauer over en længere periode på time, såsom hele udvikling, og ekspression kan styres præcist ved anvendelse af forskellige lægemidler inducerbare systemer og specifikt Cre drevet ekspression. Denne særlige protokol forklarer, hvordan at injicere en virus, der udtrykker en sgRNA og Cas9 til knockout et gen af interesse i hjernen af en voksen mus. Mus genvinde meget hurtigt fra denne procedure og ekspression af det virale transgen kan ses inden for 48 timer efter injektion. Imidlertid synes fluorofor udtryk at stige i løbet af uger resulterer i nærheden maksimale niveauer af 3 uger efter infektion. Mus, der undergår viral stereotaktisk injektion kan bruges til adfærd, elektrofysiologi, eller morfologiske undersøgelser. Samlet set er formålet med disse procedurer er at demonstrere, hvordan man knockout et gen i den voksne musehjerne hjælp stereotaktisk kirurgi og en virus, der udtrykker en bestemt sgRNA og Cas9.
Der er et par kritiske trin, der er vigtige for en vellykket viral pakning. Celle sundhed er kritisk før og under transfektion, som usunde celler i høj grad vil reducere mængden af virus produceret. Hvis transfektion og emballering er succesfulde, derefter 100% af cellerne skal udtrykke fluorophoren og cellerne bør udgøre en funktionel syncytium. I trin 3.2.4, banke på glasset er nødvendig for høj titer transfektion effektivt, og pH af den HEPES-bufret saltvand, skal være nøjagtige. De maxi-preps der producerer de plasmider, der er nødvendige for viral pakning skal være yderst rene. Til dette punkt, er det nyttigt til ethanol udfælde den endelige DNA eluering og re-suspendere i Tris-EDTA-buffer. Det er også meget vigtigt at reducere mængden af serum til 2% eller mindre i medierne, at koffein er blevet tilsat til på dag 6 (trin 3.4) før viral samling. Hvis serum ikke reduceres, så den endelige oprensede virus vil indeholde en uønsket mængde af serum protein. Anvendelsen af polyethylenglycol 6000 ved udfældning viruspartiklerne udelukker nødvendigheden af ultracentrifugering. Det er også vigtigt at bemærke, at Cas9 CRISPR indeholdende vira har typisk en titer ca. 10 gange mindre end vira udelukkende indeholdende en fluorofor.
For stereotaktisk kirurgi, brug af inhaleret anæstesi muliggør en hurtig og præcis styring eller dyrets bevidsthed sammenlignet med injicerbare anæstetika og tillader anæstesi over et større aldersgruppe. Det er meget vigtigt at holde kirurgiske instrumenter rent og sterilt, og reproducerbar målretning kræver præcis positionering af hovedet. Sørg for at der ikke er nogen pitching eller rulning af hovedet i stereotaktisk instrument, og at kraniet føles fast. Det kan være nyttigt at tillade kraniet tørre for at finde suturerne at bestemme de stereotaksiske koordinater. Desuden bør satsen og volumen for hver stereotaktisk koordinere bestemmes empirisk.
Denne teknik er begrænsende på, at spredningen af et lenti- eller retrovirus er begrænset, især sammenlignet med adenoassocierede virus (AAV'er) .Derfor disse vira er værdifulde, når inficerer en diskret område af hjernen, men ikke for den overordnede infektion i forbindelse med AAV'er anvendes til adfærdsanalyse hos dyr. Anvendelsen af koffein i denne protokol øger titeren af disse vira, men de er stadig ikke så høje som de titere opnået i AAV emballage. Også, stabil integration er kun en fordel ved fluorofor ekspression, som CRISPR / Cas9 danner stabile genomiske redigeringer selv når transient transficeret og det er muligt, at den igangværende ekspression af Cas9 og sgRNA sidste ende kan frembringe off target effekter. Den forbigående ekspression CRISPR / Cas9 systemet med AAV'er er tilstrækkelig til at frembringe genomiske ændringer, der er opformeret i hele celledelinger dog fluorofor ekspression vil ikke blive opretholdt.
Oprettelse af lenTi- og retrovira anvender CRISPR / Cas9 systemet vil bibringe evnen til at målrette enhver hidtil ukendt gen i en lang række organismer. Effektiviteten af gen redigering synes at være afhængig af sekvensen af føringen RNA rettet mod Cas9 spaltning. Det er blevet bestemt empirisk, at mellem 10% og 80% af klonerne indeholder indels efter sekventering inficerede Neuro2A celler. Det er på nuværende tidspunkt ikke, om InDel frekvenser beregnet i Neuro2A celler er reflekterende af dem i neuroner. Guide RNA design software som Benchling omfatter nu en "on target" score, der kan være i stand til at forudsige effektiviteten af et givet mål sekvens. I hvilken grad sådanne "on-target" score er pålidelige behov, der skal empirisk bestemt i neuroner og andre celletyper som CRISPR-Cas9 systemet bliver mere bredt implementeret.
Lentivirus-baserede transgene dyr produktion har været variabelt succes med rapporter om, at lentivirus-leverede transgener bliver silenced 11. CRISPR medieret gen redigering af DNA kan føres gennem kønscellerne at generere hele dyremodeller. Således kan stabil genomisk redigering kunne opnås på trods af lyddæmpning af virale-leverede fluoroforer og Cas9 transgener. Det kan give en effektiv platform for målrettet genomiske forandringer. Den virale levering af CRISPR / Cas9 system, mens de ikke kræver transgene organismer, er komplementær til disse teknikker. For eksempel injicere sådanne viruspartikler til en forbindelse transgent dyr, der inducerbart udtrykker Cre og Cre afhængige opto eller kemo-genetisk transgener bør lette komplekse undersøgelser af forholdet mellem genetiske manipulationer og neuronal aktivitet. Et andet eksempel er at levere disse Cas9 / sgRNA viruspartikler en betinget knockout i et forsøg på at screene for genet-gen interaktioner. Endelig er en anden spændende rute med denne forskning er screening af fænotyper og terapeutiske forbindelser i patientens afledte celler, som kanbruges til at validere og opdage genetiske netværk, der er afbrudt i forskellige sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Ninh give R01MH097949 og Autism Speaks Pilot Grant 7359 til BWL og Norris Cotton Cancer Center Optical Imaging Shared Instrumentation Grant P30CA023108.
List of Cell Culture Reagents | |||
293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine solution, 100X (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
Polystyrene 10cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-053-CI |
|
Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
List of Transfection Reagents | |||
5ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | S369-500 | |
(Na2HPO4) | |||
2X HEPES Buffered Saline (HBS) | 500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
filter and store at 4°C | |||
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
60CC L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
10ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
Stereotaxic Surgery Reagents | |||
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
Isoflurane | |||
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
MONOJECT® Needles Soft Pack 25g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 |