Den crispr / Cas9-systemet ger möjlighet att göra riktad genom att redigera tillgängliga och överkomliga för det vetenskapliga samfundet. Detta protokoll är avsett att visa hur man skapar virus som kommer knockout en gen av intresse med hjälp av crispr / Cas9-systemet, och sedan injicera dem stereotaktiskt i den vuxna musen hjärnan.
Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism’s genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.
För att studera grundval av normal fysiologi och sjukdomspatologi, finns det ett behov att exakt manipulera genuttryck i modellorganismer. För däggdjursmodellorganismer, är detta till stor del inriktad på skapandet och utvecklingen av transgena möss, där en genetisk element av intresse flankeras av platser som känns igen av ett rekombinas. Detta kan resultera i en lägesspecifik manipulation av dessa flankerade gener. Även om detta har varit en framgångsrik strategi, är det dags och resurskrävande; till exempel skapa en trippel transgent djur som skulle uttrycka en floxed gen, Cre rekombinas och en Cre reportergen kräver flera parningar och validering. I motsats härtill stereotaxic injektion av replikering defekta virala partiklar som kodar för ett fluorescerande protein och rekombinaset till en floxed gen djur inte kräver komplex genotypning eller avelsstrategier 1. Vidare, om ett fluorescerande protein och Cre uttryckande virus är sam-injiceras med ett andra virus Encoding en annan fluorescerande protein, då detta ger en inom-vävnadskontroll för målinriktad genetisk manipulation. Även om denna strategi kräver fortfarande användningen av knock-in djur, viralt medierade RNA baserade strategier kringgå behovet av transgena djur. Till exempel, kan stereotaxisk injektion av replikationsdefekta virus som kodar för ett fluorescerande protein och en kort hårnål RNA (shRNA) använd endogen maskiner cellens RNAi för att resultera i en potent reduktion av transkriptet av en gen av intresse. Men shRNA strategier producera subtila gen knock-downs ofta resulterar i måttliga cellulära fenotyper 2. Medan en knock-down kan vara mer fysiologiskt relevant för heterozygot gen dysfunktion, dess minskade robusthet jämfört med en knock-out är inte idealiskt för fenotypisk upptäckten av nya gener.
En tredje teknik som nyligen har dykt upp, den crispr (Clustered regelbundet mellanrum Kort palindrom Repeat) / Cas9 (crispr associeradeprotein 9) system förlitar sig på uttrycket av både en liten exogen RNA och ett DNA-skärande enzym. Den crispr / Cas9 systemet anpassades från den prokaryota immunsystemet som utvecklades en metod för att identifiera främmande, invaderande DNA från virus och inrikta den för nedbrytning via Cas9 enzymet 3,4. Denna kraftfulla genom redigering teknik kan användas för att skapa riktade deletioner, insättningar och mutationer; och följande protokoll kommer att beskriva hur man gör strykningar i en gen av intresse för att knockout sitt uttryck in vivo. Den Cas9 enzymet måste uttryckas med en guide-RNA homolog med regionen av intresse och sammanhängande med en byggnadsställning RNA. Knockout av en gen med hjälp av denna teknik kräver inriktning Cas9 till en specifik region i genomet med användning av syntetiska styr RNA (sgRNA), och förmå dubbelsträngade avbrott (DSB) vid ett område av intresse. Dessa DSB sedan repareras av den endogena cell reparation maskiner via icke-homolog slut sammanfogning (NHEJ) som leannons InDels som kan ge missense eller nonsensmutationer och kan därför skapa en förlust av funktionell proteinuttryck 5. Eftersom detta system producerar genomiska förändringar, endast kräver den övergående uttryck av Cas9 och sgRNA. Emellertid är det önskvärt att en stabil fluorescerande indikator för att identifiera celler och deras avkomma manipulerade på detta sätt.
Lenti- och retrovirus har fördelen att stabilt integrera DNA av intresse i värdceller som bibehåller långsiktig expression och går i arv till dotterceller under mitos. Detta protokoll beskriver konstruktion och produktion av två typer av replikationsdefekta, hög titer retrovirus: humant immunbristvirus härledda lentivirala partiklar (lentivirus) och de grundar sig på murin Maloney leukemivirus (retrovirus). Även om båda av dessa virus är kapabla att stödja stabil uttrycka av stora transgener kan retroviruspartiklar bara integreras i genomet during celldelning med nedbrytningen av kärnhöljet, och kan därför användas som ett verktyg för att märka och födelsedatum celler 6. Medan lentivirus har ett rykte om att vara relativt låg titer 7, denna metod, inklusive användning av koffein 8 under viral samling, producerar rutinmässigt titrar av 10 9 och 10 10 partiklar / ml. En annan fördel med lenti- och retrovirus är toleransen för mycket stora insatser. Följande samling av protokoll beskriver förfarandet för att utforma ett lenti eller retrovirus som kodar för en fluorescerande reporter, sgRNAs och Cas9 att utnyttja crispr / Cas9 systemet för att modifiera DNA samt uttrycker ett fluorescerande protein.
Mus stereotaktisk neurokirurgi är en värdefull metod för att injicera virus in vivo för att studera morfologi, funktion och anslutning av infekterade nervceller. Viral infektion i neuroner kan användas för att manipulera expressionsnivåer över en förlängd period av time, såsom genom hela utvecklingen, och uttryck kan styras exakt genom användning av olika läkemedels inducerbara system och specifika Cre driven expression. Denna speciella protokoll förklarar hur man injicerar en virus som uttrycker en sgRNA och Cas9 att knockout en gen av intresse i hjärnan hos en vuxen mus. Möss återhämta sig mycket snabbt från detta förfarande och expression av den virala transgenen kan ses inom 48 timmar efter injektion. Dock verkar fluoroforen uttryck att öka under loppet av veckor resulterar i nära maximala nivåer av 3 veckor efter infektion. Möss som genomgår viral stereotaxisk injektion kan användas för uppförande, elektrofysiologi, eller morfologiska studier. Totalt sett är syftet med dessa förfaranden för att visa hur man knockout en gen i den vuxna musen hjärnan med hjälp av stereotaktisk kirurgi och ett virus som uttrycker en specifik sgRNA och Cas9.
Det finns några viktiga steg som är viktiga för en framgångsrik viral förpackningar. Cell hälsa är avgörande före och under transfektion, som sjuka celler kommer att kraftigt minska mängden virus som produceras. Om transfektion och förpackningen är framgångsrika, då 100% av cellerna ska uttrycka fluoroforen och cellerna bör utgöra en funktionell syncytium. I steg 3.2.4, knacka på röret är nödvändig för hög-titer transfektion effektivt, och pH för den HEPES-buffrad saltlösning måste vara exakt. Maxi-preps som producerar plasmiderna som är nödvändiga för viral förpackningar måste vara extremt ren. Till denna punkt, är det till hjälp att etanol utfälla den slutliga DNA-eluering och återsuspendera i Tris-EDTA-buffert. Det är också mycket viktigt att minska mängden serum till 2% eller mindre i media som innehåller koffein som tillsatts till Dag 6 (steg 3,4) innan viral samlingen. Om serumet inte minskas, då det slutliga renade viruset kommer att innehålla en oönskad mängd serum protein. Användningen av polyetylenglykol 6000 när utfällning av virala partiklar utesluter nödvändigheten av ultracentrifugering. Det är också viktigt att notera att de Cas9 crispr innehållande virus har typiskt en titer cirka 10 gånger mindre än virus enbart innehållande en fluorofor.
För stereotaxic kirurgi, användning av inhalerat anestesi tillåter snabb och exakt kontroll eller djurets medvetande jämfört med injicerbara narkosmedel och tillåter anestesi över ett större åldersintervall. Det är mycket viktigt att hålla de kirurgiska instrumenten rena och sterila, och reproducerbar målinriktning kräver exakt positionering av huvudet. Se till att det inte finns någon pitching eller rullning av huvudet i stereotaxic instrument och att skallen känns stadigt på plats. Kan det vara användbart att låta skallen för att torka för att finna suturerna för att bestämma de stereotaxic koordinater. Dessutom bör hastigheten och volymen för varje stereotaxisk koordinat bestämmas empiriskt.
Denna teknik är begränsande i att spridningen av en lenti- eller retrovirus är begränsad, särskilt jämfört med adenoassocierade virus (AAV) .Därför, dessa virus är värdefulla när infektera en diskret hjärnregion, men inte för övergripande infektion associerad med AAV används för beteendeanalys hos djur. Användningen av koffein i detta protokoll ökar kraftigt titer av dessa virus, men de är fortfarande inte lika höga som de titrar som uppnåtts i AAV förpackning. Dessutom är stabil integration endast en fördel med fluorofor uttryck, som crispr / Cas9 bildar stabila genomiska redigeringar även när transfekterades transient och det är möjligt att den pågående uttryck av Cas9 och sgRNA kan så småningom producera off rikteffekter. Den övergående uttryck crispr / Cas9 systemet med AAV är tillräcklig för att ge genomiska förändringar som fortplantas genom celldelningar, dock fluoroforen uttrycket inte upprätthållas.
Skapande av lenTi- och retrovirus utnyttjar crispr / Cas9 systemet kommer att bibringa förmågan att rikta någon ny gen i en stor mångfald av organismer. Effektiviteten av gen redigering förefaller vara beroende på sekvensen av styr RNA targeting den Cas9 klyvning. Det har empiriskt bestämts att mellan 10% och 80% av klonerna innehåller InDels efter sekvense infekterade Neuro2A celler. Det är för närvarande okänt om Indel frekvenser beräknade i Neuro2A celler reflekterar dem i nervceller. Guide RNA design mjukvara som Benchling inkluderar nu en "on-mål" poäng som kan kunna förutsäga effektiviteten av en given målsekvens. I vilken grad sådana "on-mål" poäng är tillförlitliga behöver bestämmas empiriskt i nervceller och andra celltyper som crispr-Cas9 systemet blir mer allmänt genomförts.
Lentivirus-baserad transgen djurproduktion har varit löst framgångsrik med rapporter om att lentivirus levererade transgener blir silenced 11. Crispr medierad gen redigering av DNA kan föras genom könscellinjen för att generera hela djurmodeller. Sålunda kan stabil genomisk redigering kunna uppnås trots tysta virus levererade fluoroforer och Cas9 transgener. Detta kan ge en effektiv plattform för riktade genomiska förändringar. Den virala leverans av crispr / Cas9-systemet, utan kräver transgena organismer, är ett komplement till dessa tekniker. Till exempel injicera sådana viruspartiklar till en förening transgent djur som inducerbart uttrycker Cre och Cre beroende optoelektroniska eller cellgifter-genetiska transgener bör underlätta komplexa studier i förhållandet mellan genetiska manipulationer och neuronal aktivitet. Ett annat exempel är att leverera dessa Cas9 / sgRNA viruspartiklar i en villkorad knockout i ett försök att screena för genen-gen interaktioner. Slutligen är en annan spännande väg av denna forskning screening av fenotyper och terapeutiska föreningar i patient härledda celler, som kananvändas för att validera och upptäcka genetiska nätverk som störs i olika sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Ninh bevilja R01MH097949 och Autism Speaks Pilot Grant 7359 till BWL och Norris Cotton Cancer Center optisk avbildning Delad Instrumentation Grant P30CA023108.
List of Cell Culture Reagents | |||
293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine solution, 100X (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
Polystyrene 10cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-053-CI |
|
Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
List of Transfection Reagents | |||
5ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | S369-500 | |
(Na2HPO4) | |||
2X HEPES Buffered Saline (HBS) | 500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
filter and store at 4°C | |||
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
60CC L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
10ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
Stereotaxic Surgery Reagents | |||
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
Isoflurane | |||
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
MONOJECT® Needles Soft Pack 25g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 |