Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mieloides da pele de camundongos e drenar linfonodos após injeção intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. A citometria de fluxo das células coletadas fornece um ensaio confiável para caracterizar a resposta inflamatória da pele e dos linfonodos de drenagem ao parasita.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados
Neste artigo
Resumo
Resumo
Infecção da malária começa quando a fase de esporozoíto do Plasmodium é inoculada na pele de um mamífero hospedeiro através de uma picada de mosquito. O parasita altamente móveis não só atinge o fígado para invadir hepatócitos e se transformar em forma de eritrócitos-infeccioso. É também migra para a pele e para o nó de linfa de drenagem proximal do local de injecção, onde pode ser reconhecido e degradado por residente e / ou células mielóides recrutados. Imagens intravital informou o recrutamento precoce de leucócitos positivos brilhantemente fluorescente Lys-GFP na pele e as interações entre os esporozoítos e CD11c + células do linfonodo de drenagem. Nós apresentamos aqui um procedimento eficiente para recuperar, identificar e enumerar as subpopulações de células mielóides que são recrutados para a pele do rato e drenagem dos linfonodos após a injecção intradérmica de doses imunizantes de esporozoítos num modelo murino. Caracterização fenotípica utilizando fluxo multi-paramétrico fornece citometriaum ensaio fiável para avaliar alterações precoces celulares dinâmicas durante a resposta inflamatória à infecção por Plasmodium.
Introdução
A malária é uma das mais mortais doenças infecciosas no mundo, matando mais de meio milhão de pessoas por ano. A infecção pelo Plasmodium, o agente causador da doença, começa por uma fase de pré-eritrocítico (PE). Durante esta fase, os esporozoitos injectados na pele hospedeiro por um mosquito fêmea Anofelíneos atingir o fígado através da corrente sanguínea e diferenciam hepatócitos no interior para as formas de parasitas que infectam as células vermelhas do sangue e causam os sintomas da doença.
Os estágios PE de Plasmodium representar um alvo privilegiado para a vacinação anti-malária. Na verdade, vacinas viva....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê do Instituto Pasteur e pelo Comitê local de Ética em Experimentação Animal (Comitê de Ética IDF-Paris 1, Paris, França; número do contrato: 2012-0015) e realizado de acordo com as diretrizes e regulamentos aplicáveis.
1. Materiais e Reagentes
- Use feminino mosquitos Anopheles stephensi (estirpe Sda500) que se alimentam de ratos infectados 3-5 dias após a emergência e traseira, como descrito anteriormente 21.
- Utilização parasitas Plasmodium berghei ANKA clone expressando o gene da proteína verde fluorescente (GFP) sob o controlo constitutivo do proteína de....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Recentemente, demonstramos que a injeção de agulha de seringa de imunizantes doses de P. berghei esporozoítos na pele do rato induz uma contratação sucessiva de neutrófilos seguidos pelos monócitos inflamatórias na pele e DLN 19. A Secção protocolo descrito acima detalha o procedimento utilizado para isolar com sucesso células mielóides ao vivo de ambos os tecidos após injecções múltiplas de grande número de esporozoítos na derme da orelha (Figuras 1 .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Na perspectiva de vacinação em larga escala de seres humanos usando uma vacina de esporozoíto da malária conjunto, um dos principais desafios para superar é desenvolver vias e métodos de administração parasita optimizadas para assegurar uma imunização bem sucedida e protecção 24,25. Nos seres humanos, a avaliação da eficácia protectora mediada por parasitas vivos atenuados (LAP) foi realizada seguindo natural mosquito morde 2, bem como intradérmica, subcutânea e 25,26 IV imunizações
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge para a leitura crítica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge ajuda para tirar fotos e Pauline Formaglio para o ensino em imagem in vivo da motilidade esporozoítos na pele do rato. Nós também gostaríamos de agradecer Marek Szatanik e do Centro de Produção e Infecção do Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) para a criação do mosquito. Este estudo foi apoiado pelo Fundo AXA Pesquisa e fundos do Laboratoire d'Excellence "Biologia Integrativa de Doenças Infecciosas Emergentes" (conceder nenhuma. ANR-10-LabX-62-IBEID).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cetamina: Imalgene® 1.000 | Merial-50 | mg/kg: injeção prévia de esporozoíto 125 mg/kg: sacrifício prévio | |
| Xilazina: Rompun® 2% | Bayer-5 | mg/kg: injeção prévia de esporozoíto 12,5 mg/kg: seringa NanoFil de sacrifício prévio | |
| + agulha de calibre 35 | World Precision Instruments | - | - |
| Seringa de insulina Omnican® 50 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | Placa | de |
| cultura de tecidos de 6 poços 9151125-MultiwellTM - ndash; Calcinha de fundo plano | BD Falcon | 353046-70 | |
| e micro; Filtro de célula M | BD Falcon | Seringa 352350-2 | |
| ml | Terumo | SS-02S-BLUE | |
| MAXTM 15 ml Tubo cônico de polipropileno | BD Falcon | 352097-BLUE | |
| MAXTM 50 ml Tubo cônico de polipropileno | BD Falcon | Tubo | |
| de Fundo Redondo de Poliestireno de 352098-5 ml com 35 µ m Tampa de Filtro | BD Falcon | ||
| 1x CaCl2- e MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094-DMEM | |
| 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021-Colagenase | |
| de Clostridium histolyticum, Tipo IV 0.5-5.0 FALGPA unidades/mg sólido | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino, tipo IV; | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µ g/ml |
| de sal dissódico EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM ou 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500-HEPES | |
| solução tampão (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Mancha azul de tripano (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Diluição 1:10 |
| Anti-camundongo CD16 / CD32 (clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | 10 µ g/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grau | Life Technologies | D21490 | 1 µ g/ml final |
| Anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 559864 | Diluição 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (clone M1/70) | BD Biosciences | 557657 | Diluição 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (Clone 5H10) | Tecnologias de Vida | MCD0830 | Diluição 1:100 |
| Camundongos C57BL/6JRj fêmeas (7 semanas de idade) | Laboratórios Janvier | - |
Referências
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
