Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Summary

Culturas de baixa densidade de neurônios primários do hipocampo geralmente requerem camada alimentadora da glia para suprir fatores neurotróficos e sustentar a longevidade. Descrevemos aqui um método simplificado para cultivar neurônios de densidade ultrabaixa em lamínulas de vidro na presença de uma camada alimentadora neuronal de alta densidade, o que facilita a investigação de mecanismos neuronais autônomos específicos.

Abstract

Cultura de neurônios do hipocampo primárias in vitro facilita interrogatório mecanicista de muitos aspectos do desenvolvimento neuronal. Dissociadas neurónios do hipocampo embrionárias muitas vezes pode crescer com sucesso em lamelas de vidro de alta densidade, sob condições isentas de soro, mas as culturas de baixa densidade, tipicamente requerem um fornecimento de factores tróficos por co-cultivando-as com uma camada alimentadora de células gliais, a preparação dos quais pode ser demorado e trabalhoso. Além disso, a presença de células da glia pode confundir a interpretação dos resultados de estudos e opõe-se sobre os mecanismos específicos de neurónios. Aqui, um método simplificado é apresentado para ultra-baixa densidade (~ 2.000 neurónios / cm ^2), a longo prazo (> 3 meses) cultura de neurónios do hipocampo primário que está sob condições isentas de soro e sem suporte de células da glia. neurónios de baixa densidade são cultivadas em lamelas de poli-revestido D-lisina, e virado em neurónios de alta densidade cultivadas numa placa de 24 poços. Em vez de utilizar pontos de parafina para criar um espaço entrn as duas camadas neuronais, os experimentadores pode simplesmente gravar o fundo de plástico do poço, em que os neurónios de alta densidade reside, para criar um micro-espaço conducente à baixa densidade de crescimento neuronal. A co-cultura pode ser facilmente mantida durante> 3 meses sem perda significativa de neurónios de baixa densidade, facilitando, assim, o estudo morfológico e fisiológico destes neurónios. Para ilustrar esta condição cultura bem sucedida, os dados são fornecidos para mostrar a formação de sinapses profusa em células de baixa densidade após cultura prolongada. Este sistema de co-cultura também facilita a sobrevivência de neurónios individuais esparsos cultivadas em substratos de ilhas de poli-D-lisina e assim a formação de ligações autaptic.

Introduction

Crescer neurónios do hipocampo em condições in vitro permite a observação e manipulação experimental desses neurônios que de outra forma não seriam possíveis in vivo. Esta abordagem experimental é amplamente utilizado para revelar os mecanismos neuronais de crescimento, polaridade, especificação de neurites, tráfico e localização subcelular das proteínas, a formação de sinapses e a maturação funcional ^1. Estes neurónios do hipocampo em cultura in vitro, quando colhido de estágios embrionários tardios, são relativamente pura (> 90%) de células glutamatérgicas morfologia piramidal ^2. Uma vez que os neurónios for....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade do Arizona, e conformado com as diretrizes do NIH.

1. Tissue Fonte para hipocampo Neuron Cultura

1. Para gerar filhotes de rato pré-natal para hipocampo neurônio cultura, usar camundongos tempo grávidas (C57BL6 / J) que são criados na casa ^17. O dia de detecção com rolhão vaginal é designado como E0.5. O tempo de colheita prevista para a cultura é E16.5-E17.5.
   Nota: Este protocolo descreve culturas de duas placas de 24 poços de dois neurónios de alta densidade de co-cultura com os n....

Results

O protocolo aqui descrito permite bem sucedida de ultra-baixa densidade, a cultura de longo prazo de neurónios glutamatérgicos puros sem a necessidade de células da glia que servem como uma camada alimentadora. O protocolo é diagramado na Figura 1, que envolve a preparação de alta densidade (em poli-D-lisina revestido 24 poços) e de neurónios de baixa densidade (em lamelas de vidro revestidas com poli-D-lisina), em separado, e subsequente co-cultura que pode ser mantida .......

Discussion

Apresenta-se um protocolo detalhado para a cultura de longo prazo de ultra-baixa densidade de hipocampo de neurónios glutamatérgicos sob condições isentas de soro. Em ~ 2000 neurônios / cm ^2, a densidade é pelo menos duas vezes menor do que a maioria preparações "baixa densidade" de cultura com ou sem apoio glia relatado pela literatura existente ^{2,3,11,13,14.} Além de ser ultra-baixa densidade, este protocolo é nova e significativa em mais duas formas. Em primeiro lugar, nenhuma camada de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Meio neurobasal	Life Technologies	21103-049	Proteger da luz
suplemento B27	Life Technologies	17504-044	alíquota, armazenar no tamanho 0.6ml
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	diluir 100X
antibiótico-antimicótico (AA)	Life Technologies	15240-096	diluído 100X
		de cultura completo	Meio neurobasal com 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Meio			igual ao 'meio neurobasal'Meio
			Neurobasal com 1X suplemento B27
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	preparar 100X estoque a 0,6 mg / ml
poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407	MW 70000-150000
tampão borato	Sigma-Aldrich	B6768 (ácido bórico); 71997 (bórax)	1,24g de ácido bórico e 1,9g de bórax em 400ml de H2O, pH a 8,5 use lamínulas
de vidro redondas HCl de 12 mm	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 vidro, compre da Carolina Biological Supply
kit de transfecção de proFection Promega		E1200	veja  protocolo para detalhes
2X HEPES tamponado com solução salina (HBS)	Promega	E1200	veja  protocolo para detalhes
Filtro de seringa	Pall Corporation	4192	0.2um tamanho de poro
Kit de preparação de plasmídeo	Endofree Qiagen	12362	de plasmídeo de grau de transfecção
Anticorpo	de camundongo MAB3418	Millipore	, anticorpo anti-p-Tau clone AP20
	Anticorpo policlonal de coelho	Millipore	AB10417
anticorpo anti-NR1 Anticorpo	Millipore	MAB1586	clone R1JHL
anticorpo anti-GluR1	Anticorpo policlonal de coelho	Millipore	AB1504
Solução salina balanceada de Hank	ThermoFisher	14025092	tamanho de 500ml