Une méthode simplifiée pour les ultra-basse densité, à long terme primaire hippocampique Neuron Culture

Summary

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Abstract

La culture de neurones hippocampiques primaires in vitro facilite l' interrogation mécaniste de nombreux aspects du développement neuronal. neurones hippocampiques embryonnaires dissociées peuvent souvent se développer avec succès sur des lamelles de verre à haute densité dans des conditions sans sérum, mais les cultures à faible densité nécessitent généralement une alimentation de facteurs trophiques par les co-culture avec une couche glie d'alimentation, la préparation de ce qui peut prendre du temps et laborieux. En outre, la présence de cellules gliales peut fausser l'interprétation des résultats et des études opposent sur les mécanismes spécifiques des neurones. Ici, une méthode simplifiée est présentée pour ultra-basse densité (~ 2.000 neurones / cm ^2), à long terme (> 3 mois) la culture de neurones hippocampiques primaire qui est dans des conditions libres de sérum et sans support de cellules gliales. les neurones de basse densité sont cultivées sur des lamelles revêtues de poly-D-lysine et basculés sur les neurones à haute densité cultivées dans une plaque à 24 puits. Au lieu d'utiliser des points de paraffine pour créer un espace between les deux couches de neurones, les expérimentateurs peuvent simplement graver le fond en plastique du puits, où les neurones à haute densité se trouvent, pour créer un microspace propice à la croissance des neurones de basse densité. La co-culture peut être facilement maintenue pendant> 3 mois sans perte significative des neurones de basse densité, ce qui facilite l'étude morphologique et physiologique de ces neurones. Pour illustrer cet état de culture réussie, les données sont fournies pour montrer la formation des synapses profuse dans les cellules de faible densité après culture prolongée. Ce système de co-culture facilite aussi la survie des neurones individuels rares îlots cultivés dans des substrats de poly-D-lysine et donc la formation de liaisons autaptic.

Introduction

Growing neurones hippocampiques dans des conditions in vitro permet l' observation et la manipulation expérimentale de ces neurones qui sont par ailleurs pas possible in vivo. Cette approche expérimentale est largement utilisé pour révéler les mécanismes neuronaux de la croissance, la polarité, la spécification des neurites, le trafic et la localisation subcellulaire des protéines, la formation des synapses et la maturation fonctionnelle ^1. Ces tests in vitro des neurones hippocampiques en culture, lorsqu'il est récolté à partir des stades embryonnaires tardives, sont relativement pur (> 90%) des cellules glutamatergiques de la morphologie pyramidale ^2. Parce que les neurones ont été cultivées dans une surface 2-D dans des conditions in vitro, cette méthode permet une observation facile, comme l' imagerie en direct ou immunocytochimie (ICC) coloration par un seul plan focal ^3; ou manipulations, telles que le traitement médicamenteux et transfections ^3-6. Lorsqu'il est cultivé à haute densité, les neurones ont tendance à avoir des taux élevés de survie en raison de co supérieurncentrations de facteurs de croissance sécrétés en plus de la pension alimentaire du milieu de croissance, et aussi à cause de neurites mécanismes de contact dépendant ^7. Cependant, la faible densité de neurones hippocampiques sont souhaitables pour des études morphologiques, lorsqu'un neurone peut être imagée dans son intégralité ou colorées pour l'analyse de la CPI. Les neurones de faible densité sont difficiles à maintenir en culture en raison du manque de soutien paracrine et nécessitent donc souvent un soutien trophique d'un gliale (typiquement corticale astrocytes) de couche d'alimentation, qui doit être préparé avant neurone culture ^2. Lors de la co-culture avec une couche nourricière de cellules gliales, des neurones de basse densité sont cultivées sur des lamelles couvre-objet, puis basculés au-dessus de la couche de cellules gliales de sorte que les neurones de basse densité et de la glie se font face. Un petit espace confiné entre la glie et les neurones est créée en plaçant des points de cire de paraffine sur les coins des lamelles couvre -objet , en créant ainsi un «sandwich» agencement ^2,8,9. Les neurones de faible densité augmentera wurant l'espace confiné entre la glie et la lamelle couvre-objet, ce qui crée un micro-environnement permissif avec des facteurs sécrétés par les concentrés neurones et les cellules gliales. Cette approche donne de faible densité, les neurones entièrement développés qui sont espacés raisonnablement à part, donc de faciliter l'étiquetage de la CPI ou des études en direct d'imagerie.

Un inconvénient apparent de co-culture de neurone-glie, en plus d'être longue et laborieuse, est qu'elle empêche étude des spécifiques des neurones, ou cellules autonomes, des mécanismes. Bien que ce système est beaucoup moins complexe que in vivo , le tissu neuronal, l' impact de la glie sur le développement des neurones, des facteurs sécrétés par l' intermédiaire non encore totalement définies peuvent confondre les expériences ^10. Par conséquent, dans des expériences qui nécessitent l'étude des mécanismes spécifiques de neurones, les conditions de culture définies qui éliminent le sérum et la couche de support gliales sont nécessaires. Une étude antérieure a réussi à cultiver des concentrations faibles de neurones (~ 9000 cellules / ^cm2) en utilisant un eree dimensionnel matrice d'hydrogel ^11. Etant donné que la population neuronale relativement pur peut être cultivé à une densité élevée dans des conditions sans sérum sans support gliale, nous émettons l'hypothèse que l'ultra-faible densité de neurones hippocampiques peuvent être cultivées dans du sérum dépourvu de milieu de culture défini par les co-culture avec des neurones à haute densité, en d'une manière qui est analogue à celle du neurone-glie co-culture classiquement adopté. En effet, haute densité des cultures de neurones hippocampiques dans une configuration «sandwich» ont récemment été utilisé pour soutenir un petit nombre de neurones endocrines magnocellulaires spécialisés ^12.

Par conséquent, la co-culture avec des neurones à haute densité peut permettre à des neurones de basse densité pour recevoir les facteurs support trophique qui est suffisante pour permettre la survie à long terme. Ce protocole de neurones mise en culture ultra-basse densité a été ainsi formulée et validée. Le protocole peut être mis en oeuvre dans une seule expérience, en préparant haute densité (~ 250.000 cellules / ml) disneurones hippocampiques sociated d' abord, puis faire une dilution pour obtenir une densité ~ 10.000 neurones / mL (~ 3.000 neurones / lamelle, ou ~ 2.000 neurones / cm ^2), ce qui est beaucoup plus faible que la plupart ont déclaré des cultures à faible densité ^{2,3,9 , 11,13.} Cette condition de culture est vaguement appelé culture "ultra-faible densité» et utilisé avec «faible densité» inter-changeable. Les neurones à haute densité sont plaquées sur la poly-D-lysine revêtues de plaques à 24 puits; tandis que les neurones de basse densité sont ensemencées sur des lamelles de verre revêtues de 12 mm de poly-D-lysine qui sont placés dans une autre plaque à 24 puits. Les lamelles avec l'adhésion des neurones de faible densité sont retournées sur le dessus des neurones à haute densité de 2 heures plus tard, après que les neurones sont descendus et fixés aux lamelles. En outre, au lieu d'utiliser des points de cire de paraffine pour élever les lamelles au-dessus de la couche de neurones à haute densité, d'une aiguille de seringue 18 G a été utilisée pour graver le fond des plaques 24 puits avec deux bandes parallèles. Le displ résultantACED, les plastiques adjacentes fournissent un support surélevé pour les lamelles de verre. Cet espace est constamment mesurée à 150-200 um, ce qui permet l'échange d'oxygène et de milieu de culture suffisante, tout en offrant un microenvironnement avec des facteurs trophiques concentrés. Sous cette condition, les neurones de faible densité se développent beaucoup, et peuvent survivre au-delà de trois mois en culture. Lorsque ces neurones sont transfectées avec GFP plasmide après trois semaines de culture, les dendrites sont abondamment parsemés d'épines dendritiques. Comme une preuve de principe, les données sont présentées pour montrer que ce système de co-culture soutient les cultures de densité ultra-faible de neurones hippocampiques ensemencées sur poly-D-Lysine «micro-îles», où les neurones forment des connexions autaptic qui peuvent faciliter l'enquête de la cellule mécanismes -Autonome, réseau indépendant.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales impliquant des souris ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arizona, et conformes aux directives du NIH. 1. Tissue Source pour hippocampique Neuron Culture Pour générer souriceaux prénatales pour la culture des neurones hippocampiques, utiliser des souris de temps enceintes (C57BL6 / J) qui sont élevés dans la maison 17. Le jour avec détect…

Representative Results

Le protocole décrit ici permet de succès ultra-faible densité, la culture à long terme des neurones glutamatergiques purs sans avoir besoin de cellules gliales servant de couche d'alimentation. Le protocole est schématisée sur la figure 1, qui comprend la préparation de haute densité (de poly-D-lysine revêtu 24 puits) et les neurones de basse densité (à la poly-D-lysine lamelles de verre revêtues) séparément, et la co-culture subséquente qui peut être…

Discussion

Nous présentons un protocole détaillé pour la culture à long terme des neurones glutamatergiques hippocampiques ultra-basse densité dans des conditions sans sérum. A ~ 2000 neurones / cm ^2, la densité est au moins deux fois plus faible que la plupart des préparations «faible densité» de la culture , avec ou sans le soutien de la glie rapportée par la littérature existante ^{2,3,11,13,14.} En plus d'être ultra-faible densité, ce protocole est nouvelle et significative de deux façons…

Materials

Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	Protect from light
B27 supplement	Life Technologies	17504-044	aliquot, store in 0.6ml size
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	dilute 100X
antibiotic-antimycotic (AA)	Life Technologies	15240-096	dilute 100X
Complete Culture medium			Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash medium			same as 'Neurobasal medium'
Feed medium			Neurobasal with 1X B27 supplement
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	prepare 100X stock at 0.6mg/ml
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 70000-150000
borate buffer	Sigma-Aldrich	B6768 (boric acid); 71997(borax)	1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl
12-mm round glass coverslips	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply
proFection transfection kit	Promega	E1200	see  protocol for details
2X HEPES buffered saline (HBS)	Promega	E1200	see  protocol for details
Syringe filter	Pall Corporation	4192	0.2um pore size
Endofree plasmid prep kit	Qiagen	12362	for preparation of transfection grade plasmid DNA
anti-MAP2 antibody	Millipore	MAB3418	mouse antibody, clone AP20
anti-p-Tau antibody	Millipore	AB10417	rabbit polyclonal antibody
anti-NR1 antibody	Millipore	MAB1586	mouse antibody, clone R1JHL
anti-GluR1 antibody	Millipore	AB1504	rabbit polyclonal antibody
Hank's balanced salt solution	ThermoFisher	14025092	500ml size