Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento Xenopus Kidney

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para usar mapas de destino e traçadores de linhagem para direcionar injeções em blastômeros individuais que dão origem ao rim de embriões de Xenopus laevis.

Abstract

O rim embrionário de Xenopus laevis (rã), os pronephros, consiste de uma única nefrónio, e pode ser usado como um modelo para a doença renal. Embriões de Xenopus são grandes, desenvolvem externamente, e pode ser facilmente manipulado por microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, mapas destino foram estabelecidas para embriões de Xenopus. microinjecção alvejado no blast�ero indivíduo que irá, eventualmente, dar origem a um órgão ou tecido de interesse pode ser utilizado para sobre-expressar selectivamente ou derrubar a expressão do gene restrita dentro desta região, diminuição dos efeitos secundários no resto do embrião em desenvolvimento. Neste protocolo, descrevemos como utilizar estabelecidos mapas destino Xenopus para atingir o Xenopus rim em desenvolvimento (os pronephros), por microinjecção blastomere específico de embriões de células 8 4 e. A injecção de marcadores de linhagem permite a verificação de uma orientação mais precisa da injecção.Depois de embriões se desenvolveram para encenar 38-40, todo-mount imuno é usado para visualizar o desenvolvimento pronephric, ea contribuição de células-alvo para os pronephros pode ser avaliado. A mesma técnica pode ser adaptada para outros tipos de tecidos alvo para além dos pronephros.

Introduction

O rim embrionário de Xenopus, as pronephros, é um bom modelo para o estudo do desenvolvimento e doença renal. Os embriões desenvolvem externamente, são grandes em tamanho, podem ser produzidos em grandes números, e são facilmente manipulados através de microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, os genes que regulam o desenvolvimento do rim em mamíferos e anfíbios são conservados. Rins de mamíferos progredir através de três etapas: a pronephros, mesonephros e metanephros ^1, enquanto anfíbios embrionárias têm um pronephros e anfíbios adultos têm um metanephros. A unidade de filtragem básica dessas formas de rim é o néfron, e ambos os mam....

Protocol

O seguinte protocolo foi aprovado pela Universidade do Texas Health Science Center em Center em Houston para o Comitê de Animais de Laboratório de Medicina Animal Welfare, que serve como o Cuidado Institucional e Use Committee (protocolo nº: HSC-AWC-13-135).

1. Identificação e Seleção de Blastômeros para injectáveis ​​alvo de rim

1. Antes de gerar embriões, o uso de mesa normal de Xenopus ²¹ Desenvolvimento de compreender a orientação das divisões celulares precoces no embrião. Alternativamente, diagramas de acesso dos primeiros estágios de desenvolvimento de Xenopus em Xenbase ^11.
2. Acessar os mapas des....

Results

Microinjeções de 4 e 8 células de embriões de Xenopus com MEM-RFP mRNA mostram diferentes níveis de segmentação para os pronephros. A Figura 4 mostra estágio 40 embriões com MEM-RFP padrões de expressão de mRNA corretas. Os embriões foram injectados na blast�ero ventral esquerdo (Figura 4A), e classificadas para o padrão de expressão adequada de ARNm de MEM-RFP. Além de expressar MEM-RFP no sentido proximal, intermédio e distai ligar túbulos d.......

Discussion

Segmentação as pronephros de desenvolvimento de embriões de Xenopus se baseia na identificação e injetar o blastomere correta. A injecção do blastómero V2 embriões de 8 células alvo os pronephros esquerda ^18. Isso deixa os pronephros direito contralateral como um controlo interno. Se morfolino knockdown ou sobre-expressão de ARN é utilizada para alterar o desenvolvimento do rim, os pronephros direito contralaterais pode ser usado para comparar os efeitos de silenciamento de genes ou a sobre-expressão.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloreto de sódio	Fisher	S271-3
Cloreto de potássio	Fisher	P217-500
Sulfato de magnésio	Fisher	M63-500
Cloreto de cálcio	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Solução de gentamicina, 50 mg / ml	Amresco	E737-20ML
L-cisteína, 99% +	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
Placa de Petri de 100 mm x 15 mm	Mini
II	Boekel	260009	Incubadora de bancada para embriões.
		Gap43-RFP	Para fazer RNA traçador. Referência: Davidson et al., 2006.
Rodamina dextrana, 10.000 M.W.	Rastreador Invitrogen	D1817	.
Grau de biologia molecular, água purificada estéril	USP Corning	46-000-CI
7" Tubos de substituição Drummond Agulhas	microinjeção	Drummond	3-000-203-G/XL
Extrator	agulhas Sutter Instruments	P-30
Pinça fina	Dumont	11252-30	Para quebrar a ponta da agulha de microinjeção.
Microinjetor Nanoject II	Drummond	3-000-204	.
Óleo mineral, pesado	Fisher	CAS 8042-47-5	Óleo para agulhas.
27 G Agulha hipodérmica Monoject	Covidien	8881200508	Para carregar óleo mineral na agulha de microinjeção.
Seringa Luer-Lok de 5 ml	BD	309646	Para carregar óleo mineral na agulha de microinjeção.
Placa de Petri de 60 mm x 15 mm	Fisher	FB0875713A
800 mícrons Malha de poliéster	pequenas	CMY-0800-C
Pipetas de transferência	Fisher	13-711-7M	Para transferência de embriões. Corte a ponta para que os embriões sejam facilmente absorvidos pela pipeta.
Placa de cultura de células de 6 poços	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldeído	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm Frasco com rosca Fisher		03-339-25B	Para fixar, colorir e armazenar embriões.
Placa de cultura celular de 24 poços	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Etanol	Fisher	BP2818-4
Metanol	Fisher	A412-4
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x pó	Fisher	BP661-50
Albumina de soro bovino	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D Mini balancim, modelo 135	Denville Scientific	57281
Soro de cabra, origem neozelandesa	Invitrogen	16210064
Azida sódica	Fisher	S227I-25
Anticorpo monoclonal 3G8	Centro Europeu de Recursos		Anticorpo primário para marcar proximal Túbulos.
Anticorpo monoclonal 4A6	European Xenopus Resource Center		Anticorpo primário para marcar túbulos intermediários, distais e de conexão.
pAb anti-RFP, IgG/coelho purificado	MBL	PM005	Anticorpo primário para marcar o traçador Gap43-RFP.
Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG	Life Technologies	A11001	Anticorpo secundário para marcar túbulos renais.
Alexa Fluor 555 cabra anti-coelho IgG	Life Technologies	A21428	Anticorpo secundário para rotular o rastreador Gap43-RFP.
9 Placa de ponto de cavidade	Corning	7220-85
Benzoato de benzila	Fisher	105862500	Opcional - para limpeza de embriões
Álcool benzílico	Fisher	A396-500	Opcional - para limpeza de embriões