Denne procedure beskriver, hvordan man indkapsle cytochrom c (cyt. C) i silica (SiO2) sol-geler, proces disse geler til dannelse bioaerogels, og bruge disse bioaerogels til hurtigt genkende nitrogenoxid (NO) gennem en gas-fase-reaktionen. Denne type protokol kan støtte i den fremtidige udvikling af biosensorer eller andre bioanalytiske enheder.
Applikationer såsom sensorer, batterier og brændselsceller er blevet forbedret gennem brug af meget porøse aerogeler når funktionelle forbindelser er indkapslet inden for aerogeler. Men få rapporter om at indkapsle proteiner i sol-geler, der behandles til at danne aerogeler eksisterer. En procedure til indkapsling cytochrom c (cyt. C) i silica (SiO2) solgeler der er superkritisk forarbejdet til dannelse bioaerogels med gasfase-aktivitet for nitrogenoxid (NO) er præsenteret. CYT. C sættes til en blandet silicasol under kontrolleret proteinkoncentration og pufferstyrke betingelser. Solen Blandingen geleres og væsken fylder gel porerne erstattes gennem en række udvekslinger opløsningsmiddel med flydende carbondioxid. Carbondioxidet er bragt til dets kritiske punkt og udluftet for at danne tørre aerogeler med cyt. C indkapslet inde. Disse bioaerogels er kendetegnet med UV-synlig spektroskopi etd cirkulær dikroisme-spektroskopi og kan anvendes til at påvise tilstedeværelsen af gasfase nitrogenoxid. Succesen med denne procedure er baseret på regulering af cyt c. Koncentration og bufferen koncentration og kræver ikke andre komponenter såsom metal nanopartikler. Det kan være muligt at indkapsle andre proteiner ved anvendelse af en lignende fremgangsmåde gør denne fremgangsmåde vigtigt for potentielle fremtidige udvikling bioanalytisk enhed.
Cytochrom c (cyt. C) er et centralt elektron-transfer-protein involveret i kroppens cellulære respiration reaktioner. Det er blevet vist at være involveret i apoptose, en styret form for celledød, og det kan detektere sådanne små toksiske molekyler som nitrogenoxid og carbonmonoxid 1-3. Nitrogenoxid (NO) spiller en rolle i en række fysiologiske processer, der finder sted i nervesystemet, kardiovaskulære og immunforsvar. Mens cyt c. Typisk kræver et vandigt miljø pufret til pH-neutrale værdier forbliver strukturelt intakt og aktive, har forskningen vist, at cyt c. Kan bevare sin struktur og funktion i faste materialer kendt som aerogeler under visse betingelser 4-9.
Aerogeler er meget porøse materialer ofte dannet ved syntetisering sol-gel metaloxider (Mens metaloxidpartikler aerogeler er meget almindelige, har carbon og andre typer af aerogeler blevet syntetiseret. Et eksempel er InP aerogels) 10 og tørring disse solgeler på en sådan måde, at den porøse faste matrix er uændret 11-14. Alle porer i solide aerogeler resultere i langt tilgængelige overfladeareal gør aerogeler yderst anvendelige til alle applikationer, hvor overfladereaktioner er vigtige. Når kemisk eller biokemisk funktionalitet er samlet i aerogel nanoarchitecture, er det blevet vist, at den fysiske porøsitet og forøget overfladeareal af aerogeler bidrage til at forbedre sensorer, samt elektroder til batterier, brændselsceller og supercapacitor ansøgninger 11,15-23 . For at tørre aerogeler på en måde, der efterlader det porøse faste matrix uændret, er det typisk at fjerne opløsningsmidlet, som forbliver i porerne efter sol-gel-syntese ved ekstraktion superkritisk opløsningsmiddel. Enhver pore kollaps, der kan være forårsaget af overfladespændingskræfter Som opløsningsmiddel fordamper fra gelen minimeres, fordi i superkritisk tørring, en væske-damp-interface aldrig former.
<p class="jove_content"> Der er mange rapporter om hemproteiner såsom cyt c. er indkapslet i solgeler som er blevet opbevaret vådt eller der er blevet tørret ambiently 24-30. Samling af indkapslende biomolekyler i solgeler der derefter tørres superkritisk til dannelse aerogeler er sjældnere på grund af den nødvendige behandling, der kan være skadelige for strukturen af mange proteiner. I tilfælde af cyt c., Visse betingelser gør det muligt at bevare evnen af cyt c. At påvise og svare gasfase nitrogenoxid inden aerogeler. Når stabiliseret i aerogel, letter høj kvalitet porestruktur aerogelen reaktionen mellem cyt c. Og nitrogenoxid 4,8,9. CYT. C kan indkapsles i aerogeler ved først at knytte den i flere lag omkring guld eller sølv nanopartikler i opløsning 4-8. Disse flerlaget overbygninger tjener til at beskytte proteinet i aerogel matrix. I den seneste approach, som vi har udviklet, når koncentrationen protein og buffer styrke styres sammen med andre syntetiske betingelser, cyt. c bevarer integritet inden for de aerogeler selv uden metal nanopartikel indledende association 9.Syntesen begynder som mange aerogel synteser begynde ved at blande silica sol-gel forstadier for en fastsat periode. Det er efter et sæt blandetid at cyt c. Tilsættes som en pufret opløsning i blandingen. Gelering sker derefter til dannelse af en porøs silica fast struktur, hvor porerne er fyldt med vand, methanol, resterende reaktanter og biprodukter. Denne væske, som fylder porerne kan skylles ud med forskellige opløsningsmidler gennem en række udvekslinger opløsningsmiddel, de sidste udvekslinger med flydende carbondioxid finder sted i et kritisk punkt tørreapparat holdes ved lav temperatur. At bringe gelerne over den kritiske temperatur (31,1 ° C) af kuldioxid letter dannelsen af somupercritical væske inde i tryksatte apparat, som kan udluftes til dannelse tørre, meget porøse aerogeler. Den relativt lave temperatur, der kræves for carbondioxid til dannelse af en superkritisk fluid er fordelagtig sammenlignet med andre opløsningsmidler, fordi det holder proteinet under en temperatur, ved hvilken det kunne denaturere.
Vores metalnanopartiklen-fri tilgang til indkapsling cyt c. I aerogeler er fordelagtig, fordi det er en enkel procedure, som kan føre til udviklingen af et mere generelt anvendelig protokol til indkapsling af andre proteiner også. Mange proteiner kan ikke interagere med metalnanopartikler på samme måde som cyt c. Gør, og metalnanopartiklen syntese eller køb tilføjer yderligere tid og omkostninger til fremgangsmåden. De få rapporter om at indkapsle proteiner i aerogeler gøre udviklingen af denne procedure et betydeligt skridt frem til at finde en mere generel fremgangsmåde til at indkapsle andre proteiner i aerogeler, der kan hjælpe in potentielle fremtidige bioanalytiske enheder.
Protokollen afsnit af dette håndskrift skitserer, hvordan at syntetisere silica solgeler, indkapsle cyt c. I disse solgeler, tørre disse sammensatte solgeler til dannelse aerogeler, karakterisere disse bioaerogels under anvendelse af UV-synligt og cirkulær dikroisme-spektroskopi og påvise tilstedeværelsen af gasfase nitrogenoxid med disse bioaerogels. CYT. C er blevet indkapslet i aerogeler når først opløst i 4,4 til 70 mM vandige opløsninger af phosphatpuffer. Men optimeret proteinstruktur i aerogeler er fundet, at resultatet, når indkapsling 40 mM phosphatpufret opløsninger af cyt c. At producere loaded aerogel cyt c. Koncentrationer i intervallet fra 5 til 15 uM 9. Derfor protokollen nedenfor er at syntetisere aerogeler hjælp 40 mM phosphatpufret opløsninger af cyt. C resulterer i en indlæst cyt. Koncentration c i aerogeler på 15 uM. </ P>
Som beskrevet, har denne fremgangsmåde konsekvent produceret levedygtig cyt c. Indkapslet i aerogeler. Koncentrationen af cyt c. Inden for aerogeler kan varieres fra 5 til 15 um, og bufferen koncentration af den oprindelige cyt c. Opløsning indkapslet i aerogeler kan varierede fra 4,4 til 70mM phosphat uden alvorlige skadelige virkninger på levedygtighed protein. Men peak center og peak bredde den karakteristiske cyt c. Soret højdepunkt i aerogeler er tættest på, hvad de er for cyt c. I opløsning, når cyt c. Er indkapslet i aerogeler fra opløsninger med 40 mM buffer 9.
Syntesen af cyt c. -SiO 2 aerogeler påvirkes af alder nogle af udgangsreagenserne. Methanol, tetramethoxysilan, og ammoniumhydroxidopløsning er alle hygroskopiske og bør udskiftes hver en-til-to måneder. Den forøgede vand, der opbygges idisse reagenser over tid påvirker gel strukturelle karakteristika og sol-til-gel overgang tid.
Ved udførelse af superkritisk tørring, kan det kritiske punkt tørreapparater transfer båd rumme op til atten 0,5 cm tykke, 1 cm i diameter geler. Som beskrevet i protokollen sektionen, bør en bestemt fyldning og tømning procedure skal følges for at overføre kuldioxid i sol-geler. Det er vigtigt at bemærke, at i begyndelsen af dræning protokollen, dræning blanding af kuldioxid og acetone flyder på et så højt sats, drænrøret fryser stiv med fugt kondenserende til is på ydersiden. Blandingen dræne ud indeholder noget vand, da acetone er ikke vandfri og dette vand kan lejlighedsvis fryse i et omfang, drænrøret faktisk træsko. Det er nødvendigt at holde øje med sådanne træsko og at lytte efter en standsning af strømning. Afløbsventilen skal være lukket for et par min så træsko vil smelte, hvis der registreres en træsko. Iværste fald, hvis aftapningsventilen ikke er lukket, kan en træsko forårsage så meget pres for at opbygge, at drænrøret kraftigt springer ud af apparatet. Efter de første få olieskift, vil størstedelen af acetonen er blevet skyllet ud af apparatet, og forekomsten af våd is klumper vil falde drastisk. Udledningen vil gradvist ligne tøris som afvandingen protokollen fortsætter med eventuelt resterende beviser acetone tilstedeværelse (såsom duft) bliver ikke kan påvises ved afslutningen af dræning proces.
Efter carbondioxidet i apparatet har skiftet fra væske til superkritisk fluid og udluftningen er påbegyndt, er det nødvendigt at frigive fluidet ved en langsom hastighed over mindst 45 min som angivet i procedure 9. En højere hastighed for frigivelse kan nedsætte levedygtigheden af cyt c. (Som vist i figur 9) inden for aerogeler og aerogeler selv kan faktisk pause fra hinanden som the væske siv at flygte fra geler. Generelt selv når aerogeler forbliver intakte efter åbning af apparatet døren, er det vigtigt at håndtere dem omhyggeligt og skånsomt som de er skrøbelige og kan bryde nemt.
De kontrol silicageler, der hældes sammen cyt. C -SiO 2 geler anvendes efter superkritisk tørring at bestemme, om carbondioxid overførsel til gelerne var vellykket. Undertiden cyt c. -SiO 2 geler kan forekomme uklar, og det er vigtigt at bestemme, om dette skyldes overførsel ufuldstændig opløsningsmiddel eller hvis det kan have at gøre med koncentrationen af cyt c. Eller buffer indkapslet i gelerne. Hvis silicageler uden cyt. C synes at have et homogent, gennemskinnelige udseende hele vejen igennem, kan dette tages som bevis for, at opløsningsmiddel overførsel fandt sted helt selv hvis cyt. C -SiO 2 geler har nogle uklarhed for dem. Uklarhed inden for de silicageleruden cyt c. efter tørring viser, at nogle acetone forblev inde gelerne under udluftning.
Som anført i protokollen sektion, der skal tages vigtige sikkerhedsforanstaltninger ved arbejde med nitrogenoxid (NO). For at detektere NO hjælp af aerogeler, er det nødvendigt at forsegle kuvetten udmærket og at udtømme den gas, der strømmer over aerogeler i et stinkskab. Alternativt kan hele spektrofotometer blive flyttet til et stinkskab sammen med NO-gas cylinder som en ekstra sikkerhedsforanstaltning for at begrænse eksponering for NO-gas. Ved kontakt med luft NO straks vil producere den meget giftige nitrogendioxid, nitrogentetroxid eller begge dele. NO kan også reagere med vand til at producere varme og ætsende dampe. Derfor kan vedvarende udsættelse for NO resultere i direkte væv toksicitet.
Ved brug af cyt c. -SiO 2 aerogeler til at påvise tilstedeværelsen af nitrogenoxid, vil Soret-båndet indledningsvist være på ~ 408 nm og vil forskydetil ~ 414 nm i nærvær af nitrogenoxid. Efter at have skiftet tilbage til kvælstof, bør Soret bandet vende tilbage til at blive centreret på ~ 408 nm. Det kan også være muligt at anvende cyt c. -SiO 2 aerogeler til at påvise tilstedeværelsen af andre ligander såsom carbonmonoxid 27.
Forskellige offentliggjorte procedurer omfatter en ekstra trin med at kombinere guld eller sølv nanopartikler med cyt c. I opløsning før blanding med solen og superkritisk tørring til dannelse aerogeler 4-8. Sammenligning af UV-synlig spektroskopi af cyt c. Indkapslet i aerogeler med metal nanopartikler til den af cyt c. Indkapslet i aerogeler uden metalnanopartikler viser, at disse to typer af indkapslingsteknikker producere cyt c. Af tilsvarende levedygtighed inden for aerogeler (figur 5) . Imidlertid cyt c. Indkapslet med metalnanopartikler er lidt mere stabil end cyt. C indkapsled uden metalnanopartikler inden aerogelerne 9. CD-spektrene for begge typer af cyt c. Aerogeler også ligner hinanden, selv om begge er forskellige fra spektret af cyt c. I buffer der angiver en udfoldning af cyt c. Inden for aerogeler (figur 7). Tidligere rapporter om cyt. C indkapslet i aerogeler tyder på, at den cirkulære dikroisme spektroskopi er mest sandsynligt at vurdere det yderste lag af protein, udfoldet ved kontakt med silicagel inden for enten metalnanopartiklen-nukleeret flerlaget cyt c. Strukturer eller løst organiserede strukturer, der danner når der ikke metalnanopartikler er til stede i aerogeler 4,9. Størstedelen af cyt c. I begge typer af selvorganiseret struktur inde i aerogeler forbliver foldet som målt ved UV-synlig spektroskopi selv. Fordelen ved den protokol, der er beskrevet heri sans nanopartikler er, at dyre køb eller tidskrævende syntese af metalnanopartikler er ikke nødvendig. Proteiner er ikke ofte blevet indkapslet i aerogeler, og så denne procedure er vigtig, eftersom den kan føre til udvikling af en mere generel fremgangsmåde til indkapsling af andre proteiner i aerogeler med potentiel betydning for fremtidige bioanalytiske enheder.
The authors have nothing to disclose.
Støtte for dette arbejde og / eller offentliggørelse blev leveret af Science Institute of Fairfield University College of Arts og Sciences, Fairfield Universitets Faculty Research Grant, en Cottrell College Science Award fra Research Corporation for videnskab Advancement, Fairfield University College of Arts & Sciences og Fairfield University Chemistry & Biokemi afdeling. Vi takker Jean Marie Wallace for meget nyttige indsigt og rådgivning i forhold til denne generelle forskningsområde. Desuden udvider vi en meget speciel tak til alle tidligere, nuværende og fremtidige bachelor forskere fra Harper-Leatherman Research Lab.
Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C |
Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 mL, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 mL |
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0-30.0% |
General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor |
generic plastic wrap | various | ||
Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 mL syringe | |
Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
Micrometer | Central Tool Company | ||
GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
Tygon tubing | various | ||
T-switch valve | various | ||
syringe needles | various |