Här beskrivs hur att inkapsla cytokrom c (cyt. C) i kiseldioxid (SiO 2) sol-geler, process dessa geler att bilda bioaerogels, och använda dessa bioaerogels att snabbt känna igen kväveoxid (NO) genom en gas-fas reaktion. Denna typ av protokoll kan bidra till den framtida utvecklingen av biosensorer eller andra bioanalytiska enheter.
Applikationer såsom sensorer, batterier och bränsleceller har förbättrats genom användningen av mycket porösa aerogel när funktionella föreningar inkapslas inom aerogel. Men några rapporter om att kapsla in proteiner i sol-geler som behandlas för att bilda aerogeler existerar. Ett förfarande för inkapsling av cytokrom c (cyt. C) i kiseldioxid (SiO 2) sol-geler som supercritically bearbetas för att bilda bioaerogels med gasfas-aktivitet för kväveoxid (NO) presenteras. Cyt. C sätts till en blandad kiseldioxidsol under kontrollerad proteinkoncentration och buffertstyrkeförhållanden. Sol Blandningen får därefter gelas och vätskan fyller gelporerna är ersatt genom en serie av utbyte av lösningsmedel med flytande koldioxid. Koldioxiden förs till sin kritiska punkt och ventileras bort för att bilda torra aerogel med cyt. C inkapslad inuti. Dessa bioaerogels karakteriseras med UV-synlig spektroskopi end cirkulär dikroism-spektroskopi och kan användas för att detektera närvaron av gas-fas kväveoxid. Framgången med detta förfarande beror på reglering av C-koncentration och buffertkoncentrationen cyt. Och inte kräva andra komponenter såsom metallnanopartiklar. Det kan vara möjligt att inkapsla andra proteiner med användning av ett liknande tillvägagångssätt som gör detta förfarande viktig för potentiella framtida bioanalytisk enhet utveckling.
Cytokrom c (cyt. C) är en viktig elektrontransferprotein involverat i kroppens cellandningen reaktioner. Det har visats vara involverad i apoptos, en kontrollerad form av celldöd, och det kan detektera sådana små toxiska molekyler såsom kväveoxid och kolmonoxid 1-3. Kväveoxid (NO) spelar en roll i en mängd olika fysiologiska processer som äger rum i nerv-, kardiovaskulära, och immunsystem. Medan cyt c. Typiskt kräver en vattenmiljö buffrat till pH-neutral värden att förbli strukturellt intakt och aktiv, har forskning visat att cyt c. Kan bibehålla sin struktur och funktion i fasta material som är kända som aerogel under vissa förutsättningar 4-9.
Aerogeler är högporösa material ofta bildade genom att syntetisera sol-gel-metalloxider (Medan metalloxid aerogeler är mycket vanliga, har kol och andra typer av aerogeler syntetiserats. Ett exempel är InP aerogels) 10 och torkning av dessa sol-geler på ett sådant sätt att den porösa fasta matrisen lämnas oförändrad 11-14. Alla porerna i fasta aerogel resulterar i mycket tillgänglig yta gör aerogel mycket användbara för alla tillämpningar där ytreaktioner är viktiga. När kemisk eller biokemisk funktionalitet är hopsatt inuti aerogel nanoarchitecture, har det visat sig att den fysiska porositet och ökad ytarea av aerogeler bidra till att förbättra sensorer, samt elektroder för batterier, bränsleceller och superkondensatortillämpningar 11,15-23 . För att torka aerogeler på ett sätt som lämnar den porösa fasta matrisen oförändrade, är det typiskt att avlägsna lösningsmedlet som finns kvar i porerna efter sol-gel-syntes genom superkritisk lösningsmedelsextraktion. Alla por kollaps som kan orsakas av ytspänningskrafterna som lösningsmedel avdunstar från gelén minimeras eftersom överkritisk torkning, en vätske-ång-gränssnitt aldrig former.
<p class="jove_content"> Det finns många rapporter om hem-proteiner såsom cyt c. inkapslas i sol-geler som har hållits våt eller som har torkats ambiently 24-30. Rapporter av inkapslande biomolekyler i sol-geler som därefter torkas supercritically att bilda aerogeler är ovanligare på grund av den nödvändiga behandlingen, som kan vara skadligt för strukturen hos många proteiner. När det gäller cyt. C, vissa villkor gör det möjligt att behålla möjligheten för cyt. C för att upptäcka och reagera på gas-fas kväveoxid inom aerogel. När stabiliseras i aerogel, hög kvalitet porstruktur aerogelen underlättar reaktionen mellan cyt c. Och kväveoxid 4,8,9. Cyt. C kan kapslas in i aerogel genom att först associera den i flera lager runt guld eller silvernanopartiklar i lösning 4-8. Dessa flerskiktade överbyggnader tjänar till att skydda proteinet inom aerogelen matrisen. I den senaste approach som vi har utvecklat, när proteinkoncentrationen och buffertstyrka styrs tillsammans med andra syntetiska villkor, cyt c. behåller integritet inom aerogel även utan metallnanopartikel inledande förening 9.Syntesen börjar så många aerogel synteser börja genom att blanda silikasol-gel prekursorer under en viss tidsperiod. Det är efter en viss blandning tid att cyt c. Tillsätts som en buffrad lösning i blandningen. Gelning sker sedan för att bilda en porös kiseldioxid fast struktur i vilken porerna är fyllda med vatten, metanol, återstående reaktanter och biprodukter. Denna vätska som fyller porerna kan sköljas ut med olika lösningsmedel genom en serie av utbyte lösningsmedels, de sista utbyten med flytande koldioxid som äger rum inom en kritisk punkt torkningsanordning hålls vid låg temperatur. Att föra gelerna över den kritiska temperaturen (31,1 ° C) av koldioxid underlättar bildandet av somupercritical fluiden inuti den trycksatta anordningen som kan ventileras för att bilda torra, mycket porösa aerogeler. Den relativt låga temperaturen som erfordras för koldioxid för bildning av en superkritisk fluid är fördelaktig jämfört med andra lösningsmedel eftersom det håller proteinet under en temperatur vid vilken den kunde denaturera.
Vår metall nanopartikel-fri metod för att kapsla in cyt c. I aerogel är fördelaktigt eftersom det är en enkel procedur som kan leda till utveckling av en mer allmängiltig protokoll för inkapsling av andra proteiner. Många proteiner kan inte interagera med metallnanopartiklar på samma sätt som cyt. C gör och metallnanopartikel syntes eller köpa lägger till ytterligare tid och kostnad för förfarandet. De få rapporter om att kapsla in proteiner i aerogel göra utvecklingen av detta förfarande ett betydande steg framåt för att hitta ett mer allmänt förfarande för inkapsling av andra proteiner i aerogel som kan hjälpa mign potentiell framtida bioanalytiska enheter.
Protokollet delen av detta manuskript beskriver hur man syntetisera kiseldioxidsol-geler, kapsla cyt c. I dessa sol-geler, torka dessa sammansatta sol-geler för att bilda aerogel, karakterisera dessa bioaerogels användning av UV-synlig och cirkulär dikroism-spektroskopi och detektera närvaron av gas-fas kväveoxid med dessa bioaerogels. Cyt. C har framgångsrikt inkapslat i aerogel när först upp i 4,4 till 70 mM vattenlösningar av fosfatbuffert. Emellertid har optimerad proteinstruktur i aerogeler befunnits resultera när inkapsling 40 mM fosfat buffrade lösningar av cyt c. Producera loaded aerogel cyt. C koncentrationer i området av 5 till 15 ^ M 9. Därför är protokollet som ges nedan för att syntetisera aerogeler med användning av 40 mM fosfat buffrade lösningar av cyt c. Vilket resulterar i en laddad cyt. C koncentrationen i aerogeler av 15 ^ M. </ P>
Såsom beskrivits, har denna procedur konsekvent producerade viabla cyt. C inkapslad i aerogeler. Koncentrationen av cyt c. Inom de aerogeler kan varieras från 5 till 15 | iM och buffertkoncentrationen av den initiala cyt c. Lösningen inkapslas i aerogeler kan varieras från 4,4 till 70 mM fosfat utan allvarliga skadliga effekter på proteinlivsduglighet. Men toppcenter och toppbredden av den karakteristiska cyt c. Soret topp i aerogel är närmast vad de är för cyt c. I lösning när cyt. C är inkapslad i aerogeler från lösningar av 40 mM buffert 9.
Syntesen av cyt. C SiO 2 aerogel påverkas vid en ålder av några av utgångsreagens. Metanol, tetrametoxisilan, och ammoniumhydroxidlösning är alla hygroskopisk och bör bytas ut en-till-två månader. Den ökade vatten som byggs upp idessa reagens över tiden påverkar gel strukturella egenskaper och övergångstiden sol-till-gel.
När du utför överkritisk torkning, kan den kritiska punkten torkapparat överförings båt håller upp till arton 0,5 cm tjocka, geler cm diameter 1. Som framgår av protokollet avsnitt bör en särskild fyllning och tömning förfarande följas för att överföra koldioxiden i sol-geler. Det är viktigt att notera att i början av dräneringen protokoll, dränerings blandning av koldioxid och aceton strömmar med en sådan hög hastighet, att dräneringsröret fryser stel med fukt kondenserar till is på utsidan. Blandningen rinner ut innehåller lite vatten eftersom aceton är inte vattenfri och detta vatten kan ibland frysa i en omfattning som dräneringsröret faktiskt träskor. Det är nödvändigt att titta på sådana träskor och lyssna efter ett stopp av flödet. Avloppsventilen bör stängas för några minuter så att täppa smälter om en träsko upptäcks. Idet värsta scenariot, om dräneringsventilen inte är stängd, kan en täppa orsaka så mycket tryck att bygga upp, att dräneringsröret dyker kraft av apparaten. Efter de första dränerings perioder, kommer majoriteten av aceton har sköljts ut ur apparaten, och förekomsten av våt is bitar kommer att minska dramatiskt. Urladdningen kommer successivt att likna torris som dräneringen protokollet fortsätter med eventuellt kvarvarande bevis aceton närvaro (såsom doft) blir odetekterbara i slutet av dräneringsprocessen.
Efter koldioxiden i anordningen har gått från vätska till superkritiska fluiden och ventileringsprocess har påbörjats, är det nödvändigt att frigöra fluiden vid en långsam hastighet under åtminstone 45 minuter såsom anges i förfarandet 9. En högre frisättningshastighet kan minska lönsamheten i cyt c. (Som visas i figur 9) inom aerogel och aerogel själva kan faktiskt sönder som the vätska rusar att fly från gelerna. I allmänhet, även om aerogel förblir intakt efter att ha öppnat apparaten dörren, är det viktigt att hantera dem noggrant och försiktigt eftersom de är sköra och kan gå sönder lätt.
Styr silikageler som hälls vid sidan av cyt c. SiO 2 geler används efter superkritisk torkning för att avgöra om överföringen koldioxiden i gelerna var framgångsrik. Ibland cyt c. SiO 2 geler kan verka grumligt och det är viktigt att ta reda på om det är på grund av ofullständig lösningsmedel överföring eller om det kan ha att göra med koncentrationen av cyt c. Eller buffert inkapslade i gelerna. Om kiseldioxidgeler utan cyt c. Tycks ha en homogen, genomskinligt utseende hela, kan detta tas som bevis för att lösningsmedels överföringen skedde helt även om cyt c. SiO 2 geler har några grumlighet till dem. Grumlighet inom kiseldioxidgelerutan cyt c. efter torkning indikerar att vissa aceton kvar inne gelerna under ventilering.
Som framgår av protokollet avsnittet viktiga säkerhetsåtgärder måste vidtas vid arbete med kväveoxid (NO). För att detektera NR med användning av de aerogeler, är det nödvändigt att täta kuvetten mycket väl och att uttömma gas som strömmar över aerogeler i ett dragskåp. Alternativt kan hela spektrofotometer flyttas till ett dragskåp tillsammans med NO gasflaska som en extra försiktighetsåtgärd för att begränsa exponering för NO-gas. Vid kontakt med luft NO omedelbart kommer att producera den mycket giftiga kvävedioxid, kvävetetroxid eller båda. NO kan också reagera med vatten för att producera värme och korrosiva gaser. Därför kan fortsatt exponering för NO resultera i toxicitet direkt vävnad.
Vid användning av cyt. C-SiO 2 aerogeler för att detektera närvaron av kväveoxid, kommer Soret-bandet initialt att vara vid ~ 408 nm och kommer att flyttatill ~ 414 nm i närvaro av kväveoxid. Efter växla tillbaka till kväve, bör Soret-bandet vända tillbaka till att vara centrerad vid ~ 408 nm. Det kan också vara möjligt att använda cyt. C SiO 2 aerogel att detektera närvaron av andra ligander såsom kolmonoxid 27.
Olika publicerade förfaranden inkluderar en extra steget att kombinera guld- eller silvernanopartiklar med cyt. C i lösning före blandning med solen och supercritically torkning för att bilda aerogeler 4-8. Vid jämförelse av UV-synlig spektroskopi av cyt c. Inkapslad i aerogel med metallnanopartiklar till det av cyt c. Inkapslad i aerogel utan metallnanopartiklar visar att dessa två typer av inkapslingsteknik producerar cyt c. Om liknande livskraft inom aerogel (Figur 5) . Men är något stabilare än cyt den cyt c. Inkapslad med metallnanopartiklar. C kapslad utan metallnanopartiklar inom aerogel 9. CD-spektra av båda typerna av cyt c. Aerogel är också liknande, även om båda skiljer sig från det spektrum av cyt c. I buffert indikerar någon utvikning av cyt c. Inom aerogel (Figur 7). Tidigare rapporter om cyt. C inkapslade i aerogeler tyder på att cirkulär dikroism-spektroskopi är mest sannolikt att bedöma det yttersta skiktet av protein, ovikta vid kontakt med silikagel, inom antingen metall nanopartikel-kärnförsedda flerskikts cyt. C strukturer eller löst organiserade strukturer som bildar när inga metallnanopartiklar är närvarande i aerogel 4,9. Majoriteten av cyt c. Inom någon typ av självorganiserande struktur inuti aerogel förblir viks mätt med UV-synlig spektroskopi ändå. Fördelen med det protokoll som beskrivs häri sans nanopartiklar är att dyra inköp eller tidsödande syntes av metallnanopartiklar är inte nödvändigt. Proteiner har inte ofta framgångsrikt inkapslat inom aerogel, och så detta förfarande är viktigt att det kan leda till utveckling av en mer generell metod för inkapsling av andra proteiner i aerogel med potentiell betydelse för framtida bioanalytiska enheter.
The authors have nothing to disclose.
Stöd för detta arbete och / eller offentliggörande som tillhandahålls av Science Institute of Fairfield University College of Arts and Sciences, Fairfield University fakulteten bidrag, en Cottrell College Science Award från Research Corporation för vetenskap Advancement, Fairfield University College of Arts & Sciences och Fairfield University Chemistry & Biochemistry Department. Vi tackar Jean Marie Wallace för mycket hjälpsamma insikter och råd när det gäller denna allmänna forskningsområde. Dessutom sträcker vi en mycket speciell tack till alla tidigare, nuvarande och framtida grund forskare i Harper-Leatherman Research Lab.
Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C |
Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 mL, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 mL |
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0-30.0% |
General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor |
generic plastic wrap | various | ||
Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 mL syringe | |
Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
Micrometer | Central Tool Company | ||
GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
Tygon tubing | various | ||
T-switch valve | various | ||
syringe needles | various |