زراعة الخلايا الأولية الأنف طلائي من الأطفال وإعادة برمجة وإلى خلية جذعية مستحثة وافرة القدرة

Summary

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Abstract

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

Introduction

الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة من عينات الإنسان (hiPSCs) هي تكنولوجيا سريعة النمو أبحاث الخلايا الجذعية. أنها توفر بديلا لأبحاث الخلايا الجذعية الجنينية (HESC) مع عدد أقل بكثير من العيوب الأخلاقية والمعنوية ^1،2. على الرغم من أنها ليست متطابقة epigenetically إلى hESCs ^3-5، hiPSCs تقدم طريقة فريدة من نوعها لنموذج الظواهر التنمية والمرض، وأنها يمكن أن تستمد من الأنسجة ذات الصلة للدولة مرض ^5-8. يجري باستمرار استكشاف طرق جديدة لتوليد hiPSCs لتحديد أنواع الخلايا الأمثل لتبدأ، باعتبارها وسيلة لإعداد iPSCs GMP ذات جودة مناسبة لزراعة الأعضاء، وأيضا إلى زيادة في الوقت المناسب وكفاءة عملية إعادة برمجة ^6،9-11.

الهوائية الخلايا الظهارية حاسمة في تطور الالتهاب التحسسي ^12، وظهارة هي المحرك الرئيسي للاستجابات الحساسية وإعادة مجرى الهواء من خلال التفاعل مع إمانه وانسجة الخلايا. ظهارة الهوائية تلعب دورا أساسيا في نشأة واستمرار أمراض الرئة مثل الربو. ومع ذلك، أقل الهوائية الخلايا الظهارية من الصعب الحصول عليها في عملية إعداد سريرية، وخاصة من المرضى الأصحاء والأطفال. بيانات من عدة دراسات تدعم فرضية أن الخلايا الظهارية من الغشاء المخاطي للأنف هي وكيل صالح والعملي لانخفاض مجرى الهواء الخلايا الظهارية ^13-20، وخاصة عند دراسة الاستجابات لملوثات الهواء والمواد المسببة للحساسية. يتكون الغشاء المخاطي للأنف من أكثر من 90٪ الهوائية مهدبة الخلايا الظهارية وأخذ عينات من هذه الخلايا الظهارية الأنفية (NECS) لا يمكن أن يؤديها بسهولة في أطفال لا تتجاوز أعمارهم سن أربعة أو خمسة، كما أنه أقل الغازية من أساليب أخذ العينات الأخرى خلية / الأنسجة وغير يرتبط مع الحد الأدنى من خطر الآثار الجانبية مثل العدوى ^20-23. ويقدم وسيلة سريعة وبسيطة لأخذ عينات الأطفال الأصحاء والأطفال المريضة دون طويلة، لا لزوم لها، وغالبا ما تكون مؤلمة procedu القصباتالدقة التي تتطلب التخدير. وقد وجدت دراسات سابقة أن الأنواع الفرعية مرض يتصل شدة الربو ويمكن التمييز في كل من الغشاء المخاطي للأنف وكذلك عينات من الخلايا الهوائية يؤخذ من الأطفال المصابين بالربو، وكان التعبير الجيني بين أنواع الأنسجة اثنين مماثل في حوالي 90٪ من الجينات غير كل مكان ^{22 24.} كمصدر للiPSCs، NECS تقديم مزايا أكثر أنواع الخلايا الأخرى المستخدمة بشكل متكرر. وغالبا ما تستخدم الخلايا الليفية لتوليد التوجيهية، ولكن على الرغم من أن هذه الخلايا يمكن بسهولة مثقف من خزعة الجلد، وهذه العملية عادة ما يتطلب تخدير موضعي، شق، والخيوط الجراحية، ويرتبط مع بعض مخاطر العدوى. لذلك، والحصول على الموافقة المسبقة من المرضى لهذا النوع من الخزعة قد يكون من الصعب ^25. بديل واحد إلى الخلايا الليفية هي هامشية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs). ومع ذلك، قد يكون من الصعب الحصول على كمية كافية من الدم لتوليد IPSC من الأطفال المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، هناك قيود ا ف ب المصبplications لالليفية وiPSCs خلايا الدم المشتقة منها، خصوصا قدرة التمايز لبعض أنواع الخلايا ^5،26. لذلك، نظرا لإمكانية الوصول النسبي وانخفاض مخاطر الآثار الجانبية التالية جمعها، تمثل NECS مصدر خلية مثالية لتوليد IPSC من السكان الأطفال.

وقد تلقى iPSCs الكثير من الاهتمام في الآونة الأخيرة كمنصة لدراسة التنمية البشرية، وتوليد نماذج المرض جديدة، وكمصدر محتمل للخلايا لعلاجات شخصية. قبل الإمكانات الكاملة لهذه التكنولوجيا يمكن أن تتحقق، في حاجة إلى الأسس الجزيئية لعملية إعادة البرمجة إلى توضيح، ولكن في الوقت الحالي فإن هذا البروتوكول والإجراءات المبينة في إلقاء الضوء على الدراسات البحثية التي تركز على التعرض مجرى الهواء، وكذلك توفر منبرا لل دراسة آثار الأدوية شخصية تنطوي على iPSCs.

وقد أدى العمل التعاوني من عدة مختبرات للgeneratioن من تقنية ناجحة ليس فقط لأخذ عينات من الغشاء المخاطي للأنف، ولكن أيضا زراعة NECS، وإعادة برمجة هذه الخلايا iPSCs ^23. وتنص هذه المادة على الخطوط العريضة لبروتوكول لأخذ العينات المثلى، زراعة، وشروط إعادة برمجة.

Protocol

يتبع بروتوكول التالية للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث الإنسان والمؤسسات. 1. أخذ عينات من النسيج المخاطي ملاحظة: الحصول على عينات من الاشخاص الذين تكون خالية من علامات العدوى الفيروسية …

Representative Results

الجزء الأول من الأنف، ودعا دهليز الأنف، هي منطقة محاطة غضروف 29. تحتاج الفرشاة لتسير بسلاسة الماضي هذا المجال من الأنف، وراء صمام الأنف (الباطنة الفوهة، أو "الثقب الأسود" رأيت في الجزء الخلفي من n هل)، ويتم الحصول على عينة من المحارة أدنى <str…

Discussion

الخلايا الظهارية الأنفية (NECS) هي منصة الوصول إليها لدراسة أمراض الشعب الهوائية، واللجنة الوطنية للانتخابات، iPSCs توفر وسيلة مثيرة لاستكشاف تطور المرض والعلاج والعلاج ^1،31،32. يمكن الحصول عليها NECS دون إجراءات ضارة المجهدة أو يحتمل أن تكون ^6،23. في تجربتنا، وعي…

Materials

15mL conical	Fisher Scientific	14-959-49D	Protocol Step 1.1.
BEGM	Lonza	CC-3170	Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide	Life Technologies	15240-062	Protocol Step 1.1.
Penn/Strep	Life Technologies	15140-122	Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush	Fisher Scientific	22-263-357	Protocol Step 1.2.
trypan blue	Fisher Scientific	MT-25-900-CI	Protocol Step 2.1.
hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-54	Protocol Step 2.1.
PBS	Fisher Scientific	BP2438-4	Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357	Protocol Step 2.2.
cytospin funnel	Fisher Scientific	23-640-320	Protocol Step 2.2.
Cytospin 4	Fisher Scientific	A78300003	Protocol Step 2.2.
blank slide	Fisher Scientific	S95933	Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit	Fisher Scientific	22-122-911	Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1	Life Technologies	A1064401	Protocol Step 3.2.
T25 flask	Fisher Scientific	08-772-45	Protocol Step 3.3.
Trypsin	Lonza	CC-5012	Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002	Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65°C for 30min	Sigma-Aldrich	F2442	Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% -	Sigma-Aldrich	D2650	Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus*	e.g. Millipore	SCR511	Protocol Step 6.4.  A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting
polybrene	Santa Cruz Biotechnology	sc-134220	Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	GSC-6301G	Protocol Step 6.4.
hESC media	See recipe included in protocol		Protocol Step 6.11.
SB431542	Stemgent	04-0010	Protocol Step 6.11.
PD0325901	Stemgent	04-0006	Protocol Step 6.11.
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel	BD Biosciences	354277	Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well	Fisher Scientific	08-772-1B	Protocol Step 6.13.
mTeSR1	StemCell	5850	Protocol Step 6.13.
250mL disposable filter flask (0.22µm)	Fisher	SCGP-U02-RE
dispase	StemCell	7923	Protocol Step 7.3.
DMEM/F12	Life Technologies	11320-033	Protocol Step 7.3.
cell lifter	Fisher Scientific	08-100-240	Protocol Step 7.4.
hESC Media**			Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4°C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37°C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media	Invitrogen	11330-032	Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR)	Invitrogen	10828-028	0.2
200mM L-glutamine	Invitrogen	25030-081	1mM
55mM ß-mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	0.1mM
100x non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1x
2ug/mL Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)	Invitrogen	13256-029	4ng/mL