Pflegen Primäre Nasenepithelzellen von Kindern und umprogrammieren in induzierte pluripotente Stammzellen

Summary

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Abstract

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

Introduction

Induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen Proben (hiPSCs) sind eine sich schnell entwickelnde Technologie der Stammzellforschung. Sie bieten eine Alternative zu embryonalen Stammzellen (hES) Forschung mit weit weniger ethischen und moralischen Nachteile ^1,2. Obwohl sie zu hESCs ^3-5 nicht epigenetically identisch sind, bieten eine einzigartige Möglichkeit hiPSCs Entwicklung und Krankheit Phänotypen zu modellieren, und sie können ^5-8 aus Geweben mit Bezug auf die Krankheitszustand ableiten. Neue Methoden der Erzeugung von hiPSCs ständig erforscht werden optimale Zelltypen zu identifizieren , als eine Möglichkeit , mit zu beginnen, GMP-Qualität iPSCs für eine Transplantation geeignet, die Vorbereitung und auch ^6,9-11 die Aktualität und Effizienz der Reprogrammierung zu erhöhen.

Epithelzellen der Atemwege sind kritisch für die Entwicklung von allergischen Entzündung ¹² und das Epithel ist ein Haupttreiber von allergischen Reaktionen und Atemwegs Remodeling durch Interaktion mit Immune und Stromazellen. Das Atemwegsepithel spielt eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Persistenz von Lungenerkrankungen wie Asthma. Jedoch niedriger Epithelzellen der Atemwege sind schwierig in einer klinischen Umgebung, insbesondere von gesunden Kontrollpatienten und Kinder zu erhalten. Daten aus mehreren Studien unterstützen die Annahme , dass Epithelzellen aus Nasenschleimhaut sind ein gültiger und praktische Proxy für niedrigere Epithelzellen der Atemwege ^13-20, vor allem , wenn Antworten auf Luftschadstoffe und Allergene zu studieren. Die Nasenschleimhaut besteht aus mehr als 90% ciliated Epithelzellen der Atemwege und Probenahme diese Nasenepithelzellen (NECs) leicht bei Kindern im Alter von vier Jahren oder fünf durchgeführt werden, da sie weniger invasiv als andere Zell- / Gewebeprobenahmetechniken und ist im Zusammenhang mit einem minimalen Risiko von unerwünschten Ereignissen wie Infektionen ^20-23. Es bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, sowohl bei gesunden und kranken Kindern ohne lange, unnötige und oft schmerzhaft Bronchoskopie procedu zu probierenres, die Sedierung erforderlich machen. Frühere Studien haben festgestellt , dass Krankheit Asthma Schwere verwandte Subtypen können die Nasenschleimhaut in sowohl als auch Proben bronchial Zelle von asthmatischen Kindern genommen unterschieden werden, und der Genexpression zwischen den beiden Gewebetypen war ähnlich in etwa 90% der nicht-ubiquitären Gene ^{22 , 24.} Als Quelle für iPSCs, NECs bieten Vorteile gegenüber anderen Zelltypen häufig verwendet. Fibroblasten werden häufig für iPSC Erzeugung verwendet, aber obwohl diese Zellen leicht kultiviert, aus einer Hautbiopsie sein kann, dieser Vorgang erfordert typischerweise Lokalanästhesie, einen Einschnitt und Nähten ist und mit einem gewissen Infektionsrisiko verbunden. Daher kann für diese Art der Biopsie von Patienten informierte Einwilligung schwierig sein ^25. Eine Alternative zu Fibroblasten ist peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Jedoch kann es schwierig sein, ausreichend Blut für iPSC Generation von pädiatrischen Patienten zu erhalten. Darüber hinaus gibt es Einschränkungen nachgeschalteter apkationen für Fibroblasten und Blutzellen abgeleitet iPSCs, vor allem ihre Differenzierungsfähigkeit auf bestimmte Zelltypen ^5,26. Daher die relative Zugänglichkeit und der geringen Gefahr von Nebenwirkungen im Anschluss an ihre Sammlung gegeben, NECs stellen eine ideale Zellquelle für iPSC Generation von pädiatrischen Populationen.

iPS-Zellen haben für das Studium der menschlichen Entwicklung, Herstellung neuer Krankheitsmodelle, und als eine potenzielle Quelle von Zellen für personalisierte Therapien eine Menge Aufmerksamkeit vor kurzem als Plattform erhalten. Bevor das volle Potenzial dieser Technologie realisiert werden kann, müssen die molekularen Grundlagen der Umprogrammierung aufgeklärt werden, aber jetzt dieses Protokoll und die im beschriebenen Verfahren werden die Forschung Studien konzentrierten sich auf Atemwegs Belichtungen aufzuklären, sowie eine Plattform für die Auswirkungen der personalisierten Medizin zu studieren Beteiligung iPSCs.

Die gemeinsame Arbeit von mehreren Labors hat zur gene geführtn für eine erfolgreiche Technik nicht nur für die Nasenschleimhaut Abtastung, sondern auch NECs Züchten und Umprogrammieren diese Zellen zu iPSCs ^23. Dieser Artikel gibt einen Überblick über ein Protokoll für eine optimale Probenahme, Züchtung und Neuprogrammierung Bedingungen.

Protocol

Das folgende Protokoll folgt den Richtlinien der Organe menschlichen Ausschuss Forschungsethik. 1. Probenahme der Nasenschleimhaut HINWEIS: Sie erhalten Proben von Probanden, die frei von Anzeichen einer Atemwegsvirusinfektion sind. Bereiten Sie eine 15 ml konischen frisch vor dem Teilnehmer besuchen und 2 ml BEGM (Bronchial Epithelzellwachstum Medium) plus 20 ul sterile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). Offene Zytologie Bürste k…

Representative Results

Der erste Teil der Nase, der Nasenvorhof genannt wird , ist der Bereich von Knorpel umgeben 29. Die Bürste muss glatt gehen vorbei diesem Bereich der Nase, über die Nasenklappe (Ostium internum oder das "schwarze Loch" auf der Rückseite des Nare zu sehen ist ), und die Probe wird von der unteren Nasenmuschel (Abbildung 1) erhalten. Die Nasenmuscheln sind knöcherne Strukturen, die die Oberfläche der Nase 29, so dass sie eine ideale Lag…

Discussion

Nasale Epithelzellen (NECs) sind eine leicht zugängliche Plattform für Atemwegserkrankungen zu studieren und NEC-iPS – Zellen bieten einen spannenden Weg die Entwicklung der Krankheit, Behandlung und Therapie ^1,31,32 zu erkunden. NECs kann leicht ohne stressig oder potenziell schädlichen Verfahren ^6,23 erhalten werden. Unserer Erfahrung nach der Probenahme der Nasenschleimhaut, wie in diesem Protokoll beschrieben wird weniger Stress und besser als die Blutentnahme für Kinder wahrgenommen werden…

Materials

15mL conical	Fisher Scientific	14-959-49D	Protocol Step 1.1.
BEGM	Lonza	CC-3170	Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide	Life Technologies	15240-062	Protocol Step 1.1.
Penn/Strep	Life Technologies	15140-122	Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush	Fisher Scientific	22-263-357	Protocol Step 1.2.
trypan blue	Fisher Scientific	MT-25-900-CI	Protocol Step 2.1.
hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-54	Protocol Step 2.1.
PBS	Fisher Scientific	BP2438-4	Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357	Protocol Step 2.2.
cytospin funnel	Fisher Scientific	23-640-320	Protocol Step 2.2.
Cytospin 4	Fisher Scientific	A78300003	Protocol Step 2.2.
blank slide	Fisher Scientific	S95933	Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit	Fisher Scientific	22-122-911	Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1	Life Technologies	A1064401	Protocol Step 3.2.
T25 flask	Fisher Scientific	08-772-45	Protocol Step 3.3.
Trypsin	Lonza	CC-5012	Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002	Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65°C for 30min	Sigma-Aldrich	F2442	Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% -	Sigma-Aldrich	D2650	Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus*	e.g. Millipore	SCR511	Protocol Step 6.4.  A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting
polybrene	Santa Cruz Biotechnology	sc-134220	Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	GSC-6301G	Protocol Step 6.4.
hESC media	See recipe included in protocol		Protocol Step 6.11.
SB431542	Stemgent	04-0010	Protocol Step 6.11.
PD0325901	Stemgent	04-0006	Protocol Step 6.11.
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel	BD Biosciences	354277	Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well	Fisher Scientific	08-772-1B	Protocol Step 6.13.
mTeSR1	StemCell	5850	Protocol Step 6.13.
250mL disposable filter flask (0.22µm)	Fisher	SCGP-U02-RE
dispase	StemCell	7923	Protocol Step 7.3.
DMEM/F12	Life Technologies	11320-033	Protocol Step 7.3.
cell lifter	Fisher Scientific	08-100-240	Protocol Step 7.4.
hESC Media**			Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4°C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37°C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media	Invitrogen	11330-032	Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR)	Invitrogen	10828-028	0.2
200mM L-glutamine	Invitrogen	25030-081	1mM
55mM ß-mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	0.1mM
100x non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1x
2ug/mL Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)	Invitrogen	13256-029	4ng/mL