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Biologia do Desenvolvimento

Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

Published: March 10, 2016
doi:
10.3791/53814
, , , ,
1Pyrosequencing Core,Cincinnati Children’s Hospital, 2Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine,Seattle Children’s Hospital, 4Division of Asthma Research,Cincinnati Children’s Hospital

Summary

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Abstract

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

Introduction

Induzidas células-tronco pluripotentes a partir de amostras humanas (hiPSCs) são uma tecnologia em rápido desenvolvimento da investigação sobre células estaminais. Eles oferecem uma alternativa à investigação em células estaminais embrionárias (hESC) com muito menos inconvenientes éticos e morais 1,2. Embora eles não são idênticos epigeneticamente para hESCs 3-5, hiPSCs oferecer uma forma única para o modelo de desenvolvimento de doença e fenótipos, e eles podem ser derivados a partir de tecidos relevantes para o estado de doença 5-8. Novos métodos de hiPSCs geradoras estão constantemente a ser explorado para identificar tipos de células ideais para começar, como uma maneira de se preparar iPSCs GMP-qualidade adequados para transplante, e também para aumentar a prontidão ea eficiência do processo de reprogramação 6,9-11.

As células epiteliais das vias respiratórias são críticos no desenvolvimento de inflamação alérgica 12, e o epitélio é um importante factor de respostas alérgicas das vias aéreas e a remodelação através da interacção com Immune estromais e células. O epitélio das vias aéreas desempenha um papel essencial na origem e persistência de doenças pulmonares como a asma. No entanto, as células epiteliais das vias aéreas inferiores são difíceis de obter em um ambiente clínico, especialmente a partir de pacientes de controle saudáveis ​​e crianças. Dados de vários estudos apoiam a premissa de que as células epiteliais da mucosa nasal são uma procuração válida e prático para as vias aéreas inferiores células epiteliais 13-20, especialmente quando se estuda as respostas a poluentes do ar e alérgenos. A mucosa nasal é composto de células epiteliais das vias aéreas ciliada mais de 90% e amostragem dessas células epiteliais nasais (CNE) podem ser facilmente realizados em crianças a partir dos quatro anos de idade ou cinco, como é menos invasivo do que outras técnicas de amostragem de células / tecidos e é associado com um risco mínimo de efeitos adversos, como infecção 20-23. Ele oferece uma maneira rápida e simples para provar as crianças saudáveis ​​e doentes sem tempo, desnecessário e muitas vezes dolorosa procedu broncoscopiares que necessitem de sedação. Estudos anteriores mostraram que os subtipos de doença relacionados com a gravidade da asma podem ser distinguidos em ambos da mucosa nasal, bem como amostras de células bronquiais tomadas a partir de crianças asmáticas, e a expressão do gene entre os dois tipos de tecidos foi semelhante em cerca de 90% dos genes não ubíquos 22 , 24. Como fonte para iPSCs, CNE oferecer vantagens sobre outros tipos de células frequentemente utilizados. Os fibroblastos são muitas vezes utilizados para a geração de CIPS, mas apesar dessas células pode facilmente ser cultivada a partir de uma biópsia da pele, este processo normalmente requer anestesia local, uma incisão, e suturas, e está associada a um certo risco de infecção. Portanto, a obtenção de consentimento informado dos pacientes para este tipo de biópsia pode ser difícil 25. Uma alternativa para os fibroblastos são as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). No entanto, pode ser difícil de obter sangue suficiente para geração iPSC de pacientes pediátricos. Além disso, há limitações de AP jusanteplicações para fibroblastos e iPSCs de glóbulos derivados, especialmente sua capacidade de diferenciação de certos tipos de células 5,26. Portanto, dada a acessibilidade relativa e o baixo risco de efeitos colaterais após a colheita, NECs representam uma fonte de células ideal para a geração de iPSC de populações pediátricas.

iPSCs têm recebido muita atenção recentemente como uma plataforma para o estudo do desenvolvimento humano, gerando novos modelos de doenças, e como uma fonte potencial de células para terapias personalizadas. Antes de todo o potencial desta tecnologia pode ser realizado, as bases moleculares do processo de reprogramação precisam ser elucidadas, mas por agora este protocolo e os procedimentos descritos no prazo irá elucidar os estudos de pesquisa voltadas para as exposições das vias aéreas, bem como fornecer uma plataforma para estudar os efeitos da medicina personalizada envolvendo iPSCs.

O trabalho colaborativo de vários laboratórios levou à generatioN de uma técnica bem sucedida, não só para a amostragem da mucosa nasal, mas também a cultura CNE, e reprogramar essas células para iPSCs 23. Este artigo fornece um esboço de um protocolo de amostragem ideal, cultura e condições de reprogramação.

Protocol

O protocolo a seguir segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana instituições. 1. A amostragem da mucosa nasal NOTA: obter amostras de indivíduos que estão livres de sinais de infecção viral respiratória. Prepare um 15 ml fresco cónica antes da visita participante e adicionar 2 ml BEGM (brônquica epitelial Médio celular Crescimento) mais 20 ul estéril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). Abrir escova de cit…

Representative Results

A parte inicial do nariz, chamado de vestíbulo nasal, é a área cercada por cartilagem 29. A escova tem de ir suavemente passado esta área do nariz, para além da válvula nasal (ostium internum, ou o "buraco negro" visto na parte de trás da narina), e a amostra é obtida a partir da concha inferior (Figura 1). As conchas nasais são estruturas ósseas que aumentam a área da superfície do nariz 29, o que os torna um local ideal para …

Discussion

Células epiteliais nasais (CNE) são uma plataforma acessível para o estudo de doenças das vias respiratórias, e NEC-iPSCs oferecer uma avenida emocionante para explorar o desenvolvimento da doença, tratamento e terapia 1,31,32. CNE pode ser facilmente obtida sem procedimentos prejudiciais estressantes ou potencialmente 6,23. Em nossa experiência, a amostragem da mucosa nasal, como descrito neste protocolo parece ser menos estressante e melhor percepção do que a coleta de sangue para as cri…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Facilidade Stem Cell pluripotentes ea Imagem Confocal Núcleo do Hospital Infantil de Cincinnati. Este trabalho foi apoiado por R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) e 2U19AI70235 (GKKH).

Materials

15mL conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65°C for 30min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% -  Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250mL disposable filter flask (0.22µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4°C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37°C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1mM
55mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2ug/mL Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4ng/mL
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Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).
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