Visualisatie van Twitching Beweeglijkheid en karakterisering van de rol van de<em> PilG</em> in<em> Xylella fastidiosa</em
Summary
In deze studie werd een nano-microfluïdische stroom kamer gebruikt om te visualiseren en functioneel karakteriseren het trillen beweeglijkheid van Xylella fastidiosa, een bacterie die de ziekte van Pierce veroorzaakt in Grapevine.
Abstract
Xylella fastidiosa is een Gram-negatieve non-flagellen bacterie die een aantal economisch belangrijke ziekten bij planten veroorzaakt. De spiertrekkingen beweeglijkheid biedt X. fastidiosa een middel voor de lange afstand intra-fabriek beweging en kolonisatie, bij te dragen in de richting van pathogeniciteit in X. fastidiosa. Het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa wordt beheerd door type IV pili. Type IV pili van Xylella fastidiosa worden geregeld door pilG, een chemotaxis regulator in Pil-Chp operon dat codeert voor eiwitten die betrokken zijn bij signaaltransductie. Om de rol van pilG verhelderen in het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa, een pilG deficiënte mutant Xf ΔpilG en zijn complementaire stam XfΔpilG- C met inheemse pilG werden ontwikkeld. Een microfluïdische kamers geïntegreerd met een time-lapse beeldopname systeem werd gebruikt om spiertrekkingen beweeglijkheid observeren XfΔpILG XfΔpilG- C en de wild-type stam. Met behulp van deze opname systeem, het maakt het mogelijk de lange termijn ruimtelijke en temporele observaties van aggregatie, migratie van individuele cellen en populaties van bacteriën via trillen beweeglijkheid. X. fastidiosa wild type en complementaire XfΔpilG- C-stam toonde typische trillen beweeglijkheid kenmerken rechtstreeks waargenomen in de microfluïdische stroom kamers, terwijl mutant XfΔpliG tentoongesteld de spiertrekkingen deficiënt fenotype. Deze studie toont aan dat pilG bijdraagt aan het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa. De microfluïdische stroom kamer wordt gebruikt als een middel voor het waarnemen twitching beweeglijkheid.
Introduction
Xylella fastidiosa is een Gram-negatieve non-gegeseld, pathogene bacterie die een aantal economisch belangrijke gewassen ziekten, waaronder de ziekte van Pierce in wijnstok (Vitis vinifera L.) 1,2, 3 veroorzaakt. Deze bacterie is beperkt tot de watervoerende xyleem vaartuigen. Infectie van grapevine zorgt ervoor dat de blokkade van de houtvaten en resulteert in het water stress en voedingstekorten 3. Succesvolle kolonisatie is afhankelijk van het vermogen van de bacterie om van de oorspronkelijke plaats van infectie aan de rest van de plant 3. Spiertrekkingen beweeglijkheid is een middel om flagellaire-onafhankelijke bacteriële beweging door de uitbreiding, gehechtheid, en intrekken van de polaire type IV pili 4 die gekenmerkt is in X. fastidiosa 5,6,7.
De spiertrekkingen beweeglijkheid is waargenomen door laser pincet en atomic force microscopie (AFM) 8,9,10. Met behulp van deze technieken, tbeheksen motilities gegenereerd door type IV pilus van N. gonorrhoeae pt P. aeruginosa werden gekenmerkt door fl uorescently etikettering pili en het vastleggen van hun bewegingen microscopisch. Hoewel beide methoden de kleefkracht van individuele bacteriën beschreven, de procedures ingewikkeld en tijdrovend 9,10. De micro fl uidic kamers werden gebruikt voor lange afstand migratie van afzonderlijke cellen en kleine aggregaten van bacteriecellen 5,6 waarnemen. Deze kamers zijn ontworpen als een microfabricated-nano-kanaal in een plaat geïntegreerd met een time-lapse beeldopname systeem 11,12,13,14. Micro fl uidic kamer apparaten bieden verschillende voordelen voor het bestuderen van verplaatsingsgedrag en cel-cel interacties bacteriën: (i) biedt een geïntegreerd platform meerkanaals vermogens; (Ii) het kan de bewegingen en combinaties van enkele cellen in de nano-schaal kenmerken van bacteriën te onderzoeken; (Iii) het zorgt voor directe microscopic beeldopname van bacteriële cellen en time-lapse analyse, (iv) indien langdurig ruimtelijke en temporele waarnemingen van afzonderlijke en / of populaties van bacteriën in een micro-omgeving; (V) de stroomsnelheid van kweekmedium in een kanaal kan nauwkeurig worden geregeld en (vi) in een zeer klein volume (1 ml) kweekmedium vereist voor elk experiment.
Onlangs heeft de micro fl uidic stroming systeem toegepast om het gedrag van bacteriële cellen onder verschillende micro-omgevingen 14,15,16 onderzoeken. De hechting en de bevestigingsoppervlak E. coli 15 X. fastidiosa 16 pt Acidovorax citrulli 14 tot glasoppervlakken werden beoordeeld met behulp van micro fl uidic kamers. De vorming aggregatie en bio fi lm gemedieerd door type IV pili van Acidovorax citrulli werden geanalyseerd 14. Bovendien is de beweging van A. citrulli waargenomen onder fl ow caarden aangetoond dat de type IV pili een belangrijke rol kunnen spelen in de kolonisatie en de verspreiding van A. citrulli in houtvaten onder sap fl ow omstandigheden. De spiertrekkingen motilities van Pseudomonas aeruginosa pt X. fastidiosa cellen werden met succes waargenomen tegen een vloeistof stroom in een microfabricated stromingskamer 5,6,17. Type IV pilus tekort pilB pt pilQ mutanten van X. fastidiosa bleken de snelheid van spiertrekkingen motiliteit onder stroming omstandigheden micro fl uidic apparaten 5,6,18 ingrijpend gewijzigd. De onderzoeken uitgevoerd op bacteriële hechting en beweeglijkheid in micro fl uidic apparaten aangegeven dat de micro fl uidic kamers zijn bijzonder geschikt voor het analyseren van de twitching beweeglijkheid en migratie van pili-gemedieerde bacteriën in vitro. Deze resultaten verklaren de-spiertrekkingen gemedieerde migratie mechanisme dat cel-cel hechting, aggregatie en kolonisatie binnen faciliteertde gastheer, uiteindelijk leiden tot een systemische infectie.
Pil-Chp operon van X. fastidiosa bevat pilG, Pili, pilJ, pil, chpB pt WKKC die coderen voor signaaltransductie 20. De transmembraan chemoreceptors binden chemische stimuli in de periplasmatische domein en activeert een signalerende cascade in hun cytoplasma deel om uiteindelijk onder controle bacteriële trillen beweeglijkheid. In de Pil-Chp operon van X. fastidiosa, een fosfo-shuttle eiwit PilG is een homoloog te CheY. In E. coli pt P. aeruginosa, CheY is het antwoord regulator in chemotaxis systemen die interageren met de flagella motor-eiwitten 19, 21. Hoewel de bijdragen van de Pil-Chp operon in de richting van virulentie in X. fastidiosa zijn onlangs onderzocht 20, de rol van pilG in chemotaxis operon in reactie op de signalen uit de omgeving en gereguleerd / motor type IV pili X. fastidiosa is uncLear. Het inzicht van chemotaxis regulator pilG verhelderen de activiteit van twitching beweeglijkheid van X. fastidiosa, is een micro fl uidic kamer gebruikt om het trillen beweeglijkheid van X. beoordelen fastidiosa. De pilG van X. fastidiosa wordt gekenmerkt door het vergelijken van de fenotypes van een deletie mutant Xf ΔpliG, complementaire stam XfΔpliG -C en de wild-type in vitro. De resultaten benadrukken de rol van pilG in het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie hebben we karakteriseerde de beweging gedrag van X. fastidiosa PilG mutant Xf ΔpilG en zijn complementaire XfΔpilG- C-stammen in nieuw ontworpen meerdere parallelle-nano-kanaals micro fl uidic kamers. De nieuw ontworpen micro fl uidic kamers kunnen maximaal vier parallelle kamers met 100 micrometer nano-kanaal in de breedte ten opzichte van eerdere modellen met slechts een enkele 50 micrometer breed kanaal 18. De verbeterde brede nano-kanaal vergem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie zijn uitsluitend genoemd voor het verstrekken van specifieke informatie en impliceert niet aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw. USDA is een gelijke kans provider en werkgever.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
Referências
- Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
- Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
- Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
- Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
- Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
- Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. Microbiology. 153, 719-726 (2007).
- Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
- Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
- Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
- Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent ‘stick-and-roll’ adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
- Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. , 751-759 (2005).
- Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
- DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
- Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
- Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
- Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
- Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
- Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
- Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
- Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
- Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce’s Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
- Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).
