Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание<em> In Vitro</em
Summary
Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Abstract
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Introduction
Гемостаз требует комбинированной и регулируемой активности клеток, белков, ионов и тканей в ограниченном пространственно – временном контексте 1. Неконтролируемое активность может привести к кровотечением или тромбозом и заболеваемости и смертности в спектре расстройств, связанных с свертывания крови. Микрожидком эксперимент Проточная камера представляет собой сложный метод , который имитирует гемостаза в пробирке. Такой подход позволяет исследовать сложного взаимодействия процессов, которые принимают участие в гемостаза с ведущей роли тромбоцитов в крови.
После повреждения сосудов, тромбоциты придерживаться подвергается субэндотелиальном матрица (глико) протеинов, чтобы предотвратить потерю крови. После адгезии, тромбоциты и активировать агрегат в ответ на авто- и паракринной сигнализации , которые в конечном итоге приводит к образованию сети тромбоцитов, стабилизированных фибрина и в результате фирмы, наматывают уплотнение тромба 2. В отличие от большинства других функций тромбоцитов испытаний, экспери-ные с проточных камер учитывают физический параметр кровотока и , следовательно , влияние реологических свойств на участвующих клеток и биомолекул 3,4.
Эксперименты проточной камеры породили знаковые идеи в гемостаза и тромбоза путем изменения ключевых параметров, которые влияют на кровоостанавливающее (суб) процессов, включая клеевой матрицы, реологических и потока профилей, клеточный состав, наличие токсинов или наркотиков, ионной силы и многое другое. В последние два десятилетия, низкая пропускная способность камеры потока экспериментов , требующих больших объемов образца (10-100 мл) развились до микрофлюидальных камер часто состоящих из маленьких камер плоскопараллельных и включая современную технологию для перфузии цельной крови при контролируемых условиях сдвига стенки 5. Microscaling значительно увеличил пропускную способность анализа в основном потому, что установка оборудования упростило и требуется меньше (крови) объем, что делает эксперимент более доступным и versatiле. Например, кровь из мелких лабораторных животных теперь могут быть использованы без необходимости жертвовать животных. Образцы крови генетически модифицированных мышей, таким образом , помогают в идентификации ключевых молекул , способствующих или ингибирующих гемостаз и в новых основных прозрений 6.
Специализированные научно – исследовательские лаборатории часто до сих пор используют выполненные на заказ камеры потока, например , из полидиметилсилоксана (PDMS) 7 , который полимеризуется на литографированных пресс – форм , которые могут быть blueprinted программным обеспечением. Результирующий камера является недорогим, одноразовые и может быть легко разобран для постфактум анализа. Кроме того, в основном любой конструкции судов, в том числе бифуркаций или резких поворотов могут быть построены по команде. Это преимущество является также его недостатком, поскольку стандартизация уже была основная проблема с проточной камеры экспериментов и PDMS на заказ камеры не помогли этим. Помимо этого конкретного вопроса, покрытия (условия), флуоресцентные зонды, антикоагулянта, TEMPтературы и время между отбором и анализом проб все плохо стандартизированы 8. Стандартизация этих переменных является сложной задачей, но тем не менее требуется, чтобы обеспечить сравнение результатов между лабораториями. Эта тема является основной темой Международного общества по изучению тромбозов и гемостаза в научной и стандартизации подкомиссии по Biorheology 9,10.
Концентратов тромбоцитов (ПК) переливается у пациентов, страдающих от различных заболеваний, которые вызывают тромбоцитопению и / или кровотечение. Но тромбоциты в ПК , как известно , уменьшают чувствительность, особенно в зависимости от времени хранения 11, процесс ухудшения в результате старения и обычно называют поражения хранения тромбоцитов. Иногда утверждают , что такие тромбоциты восстановить в обращении раз переливаемой 12, но доказательств этого не хватает. Кроме того, функция тромбоцитов, входящих в состав ПК не тестируется, так как связь между таких анализов итерапевтической или профилактической эффективности неясна 13. Микрожидком камеры потока предлагают средства для исследования функции тромбоцитов в ПК, чтобы оптимизировать цепочку манипуляций между сбором и выдачей. Это мощный инструмент исследования для прямых (спаренных) сравнений ПК , как мы уже ранее опубликованных 14,15 и описан здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микрожидком эксперименты проточной камеры являются отличным инструментом для изучения функции тромбоцитов в потоке крови и используются для оценки гемостаза в пробирке в различных экспериментальных контекстах. Несмотря на плохую межлабораторной стандартизации 9, мы пока…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
Referências
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers – a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
