En effektiv og High Yield Metode til Isolering af Mouse Dendritiske celle-undergrupper

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Dendritiske celler (DC'er) er professionelle antigenpræsenterende celler primært ansvarlige for at erhverve, bearbejdning og præsentation antigener på antigenpræsenterende molekyler at initiere T-cellemedieret immunitet. Dendritiske celler kan opdeles i flere fænotypisk og funktionelt heterogene delmængder. Tre vigtige undergrupper af milt dendritiske celler er -plasmacytoide, CD8a ^POS og CD8a ^Neg celler. De plasmacytoide DC'er er naturlige producenter af type I-interferon og er vigtige for antiviral T-celle-immunitet. Den CD8a ^Neg DC delmængde er specialiseret til MHC klasse II-antigen præsentation og er centralt involveret i priming CD4 T-celler. Den CD8a ^Pos DC'er er primært ansvarlige for cross-præsentation af eksogene antigener og CD8 T-celle priming. CD8a ^Pos DC'er har vist sig at være mest effektive ved præsentationen af glycolipid antigener ved CD1d molekyler til en specialiseret T cell befolkning kendt som invariant naturlige dræberceller T (iNKT) celler. Administration af flt-3-ligand forøger frekvensen af ​​migration af dendritiske-stamceller fra knoglemarv, i sidste ende resulterer i udvidelse af dendritiske celler i perifere lymfoide organer i murine modeller. Vi har tilpasset denne model til at oprense store antal funktionelle dendritiske celler til anvendelse i celle transfer eksperimenter for at sammenligne in vivo sprogfærdighed forskellige DC delmængder.

Introduction

Dendritiske celler (DC) blev opdaget næsten fyrre år siden som den "store stjerneformet (græsk dendron) celle" fundet i lymfoide organer ^1. Mange undersøgelser har vist, at DC'er er de eneste antigenpræsenterende celler, der effektivt kan stimulere naive T-celler ^2. En væsentlig funktion af disse celler er optagelsen og præsentation af antigener og deres effektive behandling og læsning af disse på antigen-præsenterende molekyler. I musemilt, kan DC'er adskilles i plasmacytoide og konventionelle delmængder. De plasmacytoide DC'er er kendetegnet ved lav ekspression af CD11c og høje niveauer af B220 og Gr-1. De er også positive for overflademarkør mPDCA1 og udskiller type I-interferon som reaktion på toll like receptor 9 (TLR9) ligander. De konventionelle DC'er er høje for CD11c og MHC klasse II-ekspression. De kan opdeles i tre særskilte undergrupper baseret på overfladeekspression af fænotypiske markører, såsom CD4, CD8a, DEC205, CD11b og dendritiske celle hæmmende receptor 2 (DCIR2, anerkendt af 33D1 antistof) proteiner ^3,4. CD8a ^Pos DC'er er også kendt som cDC1, er positive for DEC205, men negative for myeloide markører, såsom CD11 og 33D1. CD8a ^Neg DC'er, også kaldet Cdc2, er positive for 33D1, CD11b og CD4 men mangler DEC205. Den dobbelte negative delmængde (dvs. negativ for både CD4 og CD8a) er relativt sjælden, og er negativ for DEC205 og 33D1. Det er den mindste kendetegnet delmængde og kan være en mindre differentieret form for CD8a ^Neg DC.

Fænotypiske forskelle i de forskellige delmængder af DC'er også omfatter deres in vivo funktioner. CD8a ^Neg DC'er er meget fagocytiske og menes at præsentere exogent antigen hovedsageligt via MHC-klasse II til CD4 T-celler ^3. I modsætning hertil CD8a ^Pos DC'er er specialiseret til præsentation af opløseligt protein-antigen på MHC klasse Ii en mekanisme kaldet cross-præsentation. Resultatet af cross-præsentation afhænger af aktivering status for disse DC'er ^5, og kan enten føre til udvidelse af cytotoksiske T-celler (CTL'er) eller udvikling af regulatoriske T-celler ^{6 2,7.} Målretning af antigen til CD8a ^Pos DCs hjælp af anti-DEC205-antistof-medieret leveringsresultater stort set i sletning af T-celler ^8, mens præsentationen af antigener, der stammer fra inficerede apoptotiske celler inducerer en stærk CTL-respons ^9.

Udover anerkendelse af peptidantigener, er det mammale immunsystem udviklet sig til at genkende lipid og glycolipid-antigener. Disse antigener præsenteres af CD1-molekyler, som MHC klasse I-lignende celleoverfladeproteiner, der findes i multiple relaterede former i forskellige pattedyr. Hos mus, en enkelt type stærkt bevaret CD1 molekyle kaldet CD1d er ansvarlig for præsentation af glycolipid-antigener ^10. den største population af T-celler, der genkender CD1d / glycolipid komplekser kaldes invariante NKT-celler (iNKT celler). Disse celler udtrykker en semi-invariant T-cellereceptor (TCR) bestående af et invariant TCRα kæde, der er parret med TCRβ kæder, der har begrænset mangfoldighed ^11. I modsætning til konventionelle T-celler, der skal formering og differentiering til at blive aktiverede effektor T-celler, der findes iNKT celler som en effektor befolkning og begynde at reagere hurtigt, efter glycolipid administration ^12. Identifikation af fysiologisk relevante lipid antigenpræsenterende celler er et aktivt forskningsområde, og flere forskellige celletyper, såsom B-celler, makrofager og DC'er er blevet foreslået at udføre denne funktion. Det blev dog påvist, at CD8a ^Pos delmængde af udviklingslandene er den primære celle medierer optagelse og præsentation af lipid-antigener til mus iNKT celler ¹³ og glycolipid medieret krydspriming af CD8 T-celler ^14.

ove_content "> For at sammenligne effektiviteten af ​​antigenpræsentation ved forskellige antigenpræsenterende celler, en enkel tilgang er at overføre forskellige typer af oprensede APC'er pulseret med ækvivalente mængder af antigen i naive værter. celleoverførsel eksperimenter af denne type er ofte udføres for immunologiske undersøgelser. Men der udfører transfer studier med ex vivo antigen behandlet udviklingslandene er udfordrende, da der findes disse celler som sjældne populationer i lymfoide organer, hvor de udgør mindre end 2% af de samlede celler ^15. det er derfor nødvendigt at styrke udviklingen af disse celler i donordyr at øge effektiviteten af ​​isolation protokoller.

Det er kendt, at den fælles lymfoide og fælles myeloide stamceller, som er nødvendige til frembringelse af PDC CD8 ^Pos og CD8 ^Neg DC delmængder, hurtig fms-beslægtede receptortyrosinkinase 3 (Flt-3). Ved in vivo Flt-3 ligand (Flt-3L) administration, emigration of Flt-3 udtrykkende progenitorceller fra knoglemarv forøges, hvilket resulterer i øget podning af perifere lymfoide organer og udvidelsen af deres modne DC afkom ^16. Ekspression af Flt-3 går tabt under engagement til B, T eller NK-celle differentieringsveje. Derfor er kun minimale ændringer observeret i disse celler efter Flt-3L administration. Tilsvarende ekspansion i DC-populationer er observeret i mus, der bærer tumorer, der genereres af implantation af en B16-melanom-cellelinie udskillende murine Flt-3L, som giver en enkel og økonomisk fremgangsmåde til tilvejebringelse vedvarende systemiske niveauer af Flt-3L ^17,18. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, har vi udviklet en protokol baseret på implantation af B16-melanomceller secernerende Flt-3L at stimulere ekspansion af alle normale DC delmængder i musemilt, hvilket i høj grad øger udbytterne af disse celler, som kan isoleres til efterfølgende eksperimenter . Vi finder konsekvent at inden for 10 – 14 dage efter subkutan imbeplantning af de Flt-3 secernerende tumor, udvikler mus splenomegali med markant berigelse af DC'er at udgøre i 40 – 60% af de samlede miltceller. Fra disse milte, kan forskellige DC delmængder isoleres med høj renhed under anvendelse af standard kommercielt tilgængelige celle rensning kits, der anvender subset-specifikke fænotypiske markører.

Protocol

Dyreforsøg er færdig i overensstemmelse med godkendte retningslinjer fra den institutionelle dyr behandling og brug udvalg (IACUC). Alle procedurer, der kræver sterilitet udføres i et biosikkerhed skab. 1. Implantation af B16.Flt3L melanom i mus Kultur flt-3 udtrykkende B16 melanom cellelinie i T25 vævsdyrkningskolber ved en densitet på 0,5 x 10 6 celler / ml i komplet DMEM-medium med 10% CO2 ved 37 ° C. Vokse, indtil cellerne når ~ 90% sammenflydning…

Representative Results

Resultatet af denne procedure er afhængig af udvidelsen af ​​DC delmængder af murine Flt-3L udtrykt af de implanterede melanom celler. Den B16.Flt3L tumor blev afledt af en C57BL / 6 mus, og bør implanteret i dyr med denne stamme baggrund for at undgå svigt af tumoren at etablere grundet afvisning. I nogle tilfælde kan det være ønskeligt at anvende genetisk modificerede mus til at udlede DC'er med kendte defekter i signalveje eller receptorer af interesse. Det er vigtigt a…

Discussion

Dendritiske celler accepteres at være den væsentligste professionelle antigen-præsenterende celler involveret i priming af T-celle responser. Deres vigtigste funktion er at kortlægge vævet mikromiljø ved at optage og behandle antigener til præsentation for T-celler. For at studere funktionen af ​​specifikke delmængder af DC'er, disse skal isoleres i tilstrækkeligt antal under anvendelse af en fremgangsmåde der bevarer deres normale fænotype og funktioner. De fleste protokoller stole på isolering af s…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al. ,2000
Serum free DMEM and RPMI media
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)     5 ml HEPES Buffer (1 M)     5 ml L-glutamine (200 mM)  0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.  Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer:			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-			2,000 Units of collagenase activity per ml This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use