Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Dendritische cellen (DCs) zijn professionele antigeen presenterende cellen hoofdzakelijk verantwoordelijk voor het verkrijgen, verwerken en presenteren van antigenen op antigeenpresenterende moleculen aan T-cellen gemedieerde immuniteit te initiëren. Dendritische cellen kunnen worden gescheiden in verschillende fenotypisch en functioneel heterogene subgroepen. Drie belangrijke subsets van milt dendritische cellen zijn plasmacytoide, CD8a ^Pos en CD8a ^Neg cellen. De plasmacytoïde DCs natuurlijke producenten van type I interferon en zijn belangrijk voor antivirale T cel immuniteit. De CD8a ^Neg DC deelverzameling is gespecialiseerd voor MHC klasse II antigeen presentatie en is centraal betrokken in priming CD4 T-cellen. De CD8a ^Pos DCs zijn primair verantwoordelijk voor cross-presentatie van exogene antigenen en CD8 T-cel priming. De CD8a ^Pos DC aangetoond efficiënt bij de presentatie glycolipide antigenen door CD1d moleculen om een specifieke T cell bevolking bekend als onveranderlijk natural killer T (iNKT) cellen. Toediening van Flt-3-ligand verhoogt de frequentie van migratie van dendritische cellen uit beenmerg progenitoren uiteindelijk resulteert in het vergroten van dendritische cellen in perifere lymfoïde organen in muizenmodellen. We hebben dit model aangepast aan grote aantallen functionele dendritische cellen te zuiveren voor gebruik in celoverdracht experimenten ter vergelijking in vivo vaardigheid van verschillende DC subsets.

Introduction

Dendritische cellen (DC) werden ontdekt bijna veertig jaar geleden als "grote stervormige (Griekse dendron) cel" in lymfoïde organen ^1. Vele studies hebben aangetoond dat DCs de enige antigeen presenterende cellen die effectief naïeve T-cellen ² kunnen stimuleren. Een belangrijke functie van deze cellen is de opname en presentatie van antigenen en de efficiënte verwerking en het laden van deze op antigeen presenterende moleculen. In muis milt, kan DC worden gescheiden in plasmacytoide en conventionele subsets. De plasmacytoide DCs worden gekenmerkt door lage expressie van CD 11 c en een hoog niveau van de B220 en Gr-1. Ze zijn ook positief voor de oppervlakte marker mPDCA1 en scheiden type I interferon in reactie op toll-like receptor 9 (TLR9) liganden. De conventionele DC's zijn hoog voor CD11c en MHC klasse II expressie. Zij kunnen worden verdeeld in drie subgroepen op basis van de oppervlakte-expressie van fenotypische merkers zoals CD4, CD8a, DEC205, CD11b en dendritische celtherapie remmende receptor 2 (DCIR2, erkend door de 33D1-antilichaam) eiwitten ^3,4. De CD8a ^Pos DCs worden ook wel CDC1, zijn positief voor DEC205, maar negatief voor myeloïde merkers zoals CD11b en 33D1. De CD8a ^Neg DC's, ook wel cdc2, zijn positief voor 33D1, CD11b en CD4, maar gebrek aan DEC205. De dubbele negatieve subgroep (dwz negatief voor zowel CD4 en CD8a) is relatief zeldzaam, en is negatief voor DEC205 en 33D1. Het de minst gekarakteriseerde subgroep en kunnen minder gedifferentieerde vorm van CD8a ^Neg gelijkstroom.

Fenotypische verschillen in de verschillende DC subsets worden uitgebreid tot de in vivo functies. De CD8a ^Neg DCs sterk fagocytische en men denkt dat exogeen antigen zetten vooral via MHC klasse II aan CD4 T-cellen ^3. In tegenstelling, de CD8a ^Pos DCs zijn gespecialiseerd voor het aanbrengen van oplosbaar eiwit antigeen op MHC klasse Ieen mechanisme genaamd cross-presentatie. Het resultaat van cross-presentatie is afhankelijk van de activeringsstatus van deze DCs ^5, en kan zowel leiden tot uitbreiding van cytotoxische T-cellen (CTL's) of de ontwikkeling van regulerende T-cellen ^{6 2,7.} Targeting van antigeen aan CD8a ^Pos DCs met behulp van anti-DEC205-antilichaam-gemedieerde levering resultaten grotendeels in de verwijdering van T-cellen ^8, terwijl de presentatie van de antigenen afkomstig van geïnfecteerde apoptotische cellen een sterke CTL-respons ⁹ induceert.

Naast herkenning van peptide-antigenen is het immuunsysteem van zoogdieren ontwikkeld om lipide en glycolipide antigenen herkennen. Deze antigenen worden door CD1 moleculen, die MHC klasse I-achtige celoppervlakte-eiwitten die bestaan ​​in verschillende verwante vormen in diverse zoogdieren. In muizen, één soort sterk geconserveerde CD1 molecuul genaamd CD1d is verantwoordelijk voor de presentatie glycolipide antigenen ^10. De burgemeester populatie van T-cellen die CD1d / glycolipide complexen herkennen heet invariante NKT cellen (iNKT cellen). Deze cellen brengen een semi-invariante T-celreceptor (TCR), bestaande uit een invariant TCRα keten die is gekoppeld aan TcR ketens met een beperkte diversiteit ^11. In tegenstelling tot conventionele T-cellen die moeten groeien en te differentiëren tot geactiveerde effector-T-cellen, iNKT cellen bestaan ​​als een effector bevolking en begint snel te reageren na glycolipide toediening ^12. Identificatie van fysiologisch relevante lipide antigeenpresenterende cellen is een actief gebied van onderzoek en een aantal verschillende celtypes zoals B-cellen, macrofagen en DC's zijn voorgesteld voor deze functie. Er werd aangetoond dat de CD8a ^Pos subset van DC is de primaire cel medieert opname en presentatie van lipide antigenen muizen- iNKT cellen ¹³ en glycolipide gemedieerde cross-priming van CD8 T-cellen ^14.

ove_content "> Om de efficiëntie van antigeenpresentatie vergelijken met andere antigeenpresenterende cellen, een eenvoudige aanpak is om verschillende gezuiverde APCs gepulst met equivalente hoeveelheden van antigeen in naïeve gastheer. celoverdracht experimenten van dit type worden vaak uitgevoerd voor immunologische studies te dragen. echter, het uitvoeren van overdracht studies ex vivo antigeen behandelde DCs uitdaging, aangezien deze cellen bestaan ​​zeldzame populaties in lymfoïde organen, waar ze minder dan 2% van de totale cellen ¹⁵ vormen. daarom moet de ontwikkeling van deze cellen in donordieren verbeteren de efficiëntie van isolatie protocollen te verhogen.

Het is bekend dat de gemeenschappelijke lymfoïde en myeloïde voorlopercellen gemeenschappelijke, die nodig zijn voor het genereren van pDC, CD8 en CD8 ^{Pos Neg} DC subsets, express fms-gerelateerde tyrosine kinase receptor 3 (Flt-3). Bij het ​​in vivo Flt-3-ligand (Flt-3L) administratie, emigration van Flt-3 tot expressie stamcellen uit beenmerg wordt verhoogd, leidt tot een toegenomen zaaien van perifere lymfoïde organen en de uitbreiding van de rijpe DC ¹⁶ nageslacht. Expressie van Flt-3 is verloren tijdens betrokkenheid bij de B, T of NK-celdifferentiatie paden. Daarom worden slechts minimale veranderingen waargenomen in deze cellen op Flt-3L administratie. Vertaald expansie DC populaties waargenomen in muizen die tumoren opgewekt door implantatie van B16-melanoom cellijn afscheidende muis Flt-3L, welke een eenvoudige en economische methode voor het verschaffen van langdurige systemische niveaus van Flt-3L ^17,18 bepaalt. Met deze benadering hebben we een protocol gebaseerd op de implantatie van B16-melanoom cellen die Flt-3L de uitbreiding van alle normale DC subsets in muismilt stimuleren, waardoor aanzienlijke verhoging van de opbrengst van deze cellen kunnen worden geïsoleerd voor verdere experimenten ontwikkeld . We consequent vinden dat binnen 10 – 14 dagen na subcutane implantage van de Flt-3 afscheidende tumor, muizen ontwikkelen splenomegalie met duidelijke verrijking van DC tot 40 vormen – 60% van de totale miltcellen. Uit deze milt kunnen verschillende DC subsets worden geïsoleerd met hoge zuiverheid met behulp van standaard in de handel verkrijgbare cel zuivering kits die subgroep-specifieke fenotypische markers in dienst.

Protocol

Dierproeven worden gedaan in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van de institutionele dierlijke zorg en gebruik commissie (IACUC). Alle procedures die de steriliteit worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast. 1. Implantatie van B16.Flt3L Melanoma in Muizen Cultuur de Flt-3 expressie brengende B16 melanoma cellijn T25 weefselkweek flessen in een dichtheid van 0,5 x 10 6 cellen / ml in compleet DMEM medium met 10% CO2 bij 37 ° C. Opgroeien tot d…

Representative Results

Het resultaat van deze procedure is gebaseerd op de groei van DC subsets van murine Flt-3L door de geïmplanteerde melanoomcellen expressie. De B16.Flt3L tumor werd afgeleid van een C57BL / 6 muis en worden geïmplanteerd in dieren die stamachtergrond om falen van de tumor te vestigen door afstoting te voorkomen. In sommige gevallen kan het gewenst zijn genetisch gemodificeerde muizen om DCs met bekende defecten leiden in signaalwegen of receptoren van belang. Het is belangrijk om in ged…

Discussion

Dendritische cellen worden toegelaten tot de grootste professionele antigenpresenterende cellen betrokken bij het priming van T-cel responsen zijn. Hun belangrijkste functie is om het weefsel micro onderzoek van opnemen en verwerken van antigenen voor presentatie aan T-cellen. Om de functie van specifieke DC subsets bestuderen, moeten deze in voldoende aantallen te isoleren Daarbij moet misschien hun normale fenotype en functie handhaaft. De meeste protocollen vertrouwen op de isolatie van specifieke subgroep van DC na?…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al. ,2000
Serum free DMEM and RPMI media
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)     5 ml HEPES Buffer (1 M)     5 ml L-glutamine (200 mM)  0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.  Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer:			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-			2,000 Units of collagenase activity per ml This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use