マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法
Summary
Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.
Abstract
樹状細胞（DC）は、取得処理と、T細胞媒介性免疫を開始するための分子を抗原提示細胞に抗原を提示するために主に関与プロフェッショナル抗原提示細胞です。樹状細胞は、いくつかの表現型および機能的異種のサブセットに分離することができます。脾臓樹状細胞の三つの重要なサブセットは、CD8αPOSおよびCD8αNegの細胞形質です。形質のDCは、型の天然の生産Iインターフェロンと抗ウイルスT細胞免疫のために重要です。 CD8αNegの DCサブセットは、MHCクラスII抗原提示に特化されており、中央にCD4 T細胞のプライミングに関与しています。 CD8α 順位 DCは、外因性抗原とCD8 T細胞プライミングの交差提示を主に担います。 CD8α 順位 DCは、特殊なTセルへのCD1d分子による糖脂質抗原の提示で最も効率的であることが実証されています不変ナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞として知られているリットル人口。 FLT-3リガンドの投与は、最終的にマウスモデルにおける末梢リンパ器官における樹状細胞の増殖を生じる、骨髄由来の樹状細胞前駆体の遊走の頻度を増加させます。我々は、異なるDCサブセットのインビボでの能力を比較するため、細胞移入実験において使用するための機能的樹状細胞を大量に精製するために、このモデルを適応しています。
Introduction
「大きな星状（ギリシャデンドロン ）細胞」は、リンパ系器官1に見られるような樹状細胞（DC）は、ほぼ40年前に発見されました。多くの研究は、DCが効果的にナイーブT細胞2を刺激することができる唯一の抗原提示細胞であることを示しています。これらの細胞の主要な機能は、抗原提示分子への取り込みおよび抗原の提示とその効率的な処理およびこれらのロードをです。マウスの脾臓において、DCは、形質従来のサブセットに分離することができます。形質DCはCD11cの低い発現とB220とのGr-1の高レベルによって特徴付けられます。彼らはまた、表面マーカーmPDCA1に対して陽性であると私は受容体9（TLR9）リガンドなどの通行料に応じて型インターフェロンを分泌します。従来のDCはCD11cのとMHCクラスII発現のために高いです。彼らはそのようなCD4、CD8α、DEC205、CDなどの表現型マーカーの表面発現に基づいて、三つの異なるサブセットに分割することができます11b及び（33D1抗体によって認識DCIR2、）樹状細胞阻害受容体2タンパク質3,4。 CD8α 順位のDCも、CDC1として知られているDEC205に陽性であるが、このようなCD11bおよび33D1などの骨髄性マーカーについて陰性です。また、CDC2呼ばCD8αNegの DCは、33D1、CD11bおよびCD4陽性であるが、DEC205を欠いています。ダブルネガティブサブセット（CD4およびCD8αの両方のための、すなわち 、負）は、比較的まれで、DEC205および33D1のために負です。これは、少なくとも特徴づけられたサブセットであり、CD8αNegの DCのあまり分化の形態であってもよいです。
様々なDCサブセットにおける表現型の違いはまた、in vivoでの機能を拡張します。 CD8αNegの DCは、高い食作用であり、主にCD4 T細胞3にMHCクラスIIを介して外因性抗原を提示すると考えられています。対照的に、CD8α 順位 DCは、MHCクラスIの可溶性タンパク質抗原の提示のために特化されメカニズムに交差提示と呼ばれます。交差提示の結果は、これらのDC 5の活性化状態に依存し、細胞傷害性T細胞（CTL）または制御性T細胞を6 2,7の開発の拡大につながることができます。感染アポトーシス細胞由来抗原の提示は、強力なCTL応答9を誘導するのに対し、主としてT細胞8の削 除に抗DEC205抗体媒介送達の結果を用いて、CD8α 順位 DCに抗原の標的。
ペプチド抗原の認識に加えて、哺乳動物の免疫系は、脂質と糖脂質抗原を認識するように進化してきました。これらの抗原は、種々の哺乳動物における関連する複数の形で存在するMHCクラスI様細胞表面タンパク質であるCD1分子によって提示されます。マウスでは、CD1dのと呼ばれる高度に保存されたCD1分子の単一型は、糖脂質抗原10のプレゼンテーションを担当しています。メジャーな CD1d /脂質複合体を認識するT細胞の集団は、インバリアントNKT細胞（iNKT細胞）と呼ばれます。これらの細胞は、多様11が制限されているTCRβ鎖と対になっている不変のTCRα鎖からなる半不変T細胞受容体（TCR）を発現します。増殖し、活性化されたエフェクターT細胞になるように分化する必要があり、従来のT細胞とは異なり、iNKT細胞は、エフェクター集団として存在し、糖脂質、投与12後に迅速に対応を開始します。生理学的に関連する脂質抗原提示細胞の同定は、研究の活発な領域であり、例えば、B細胞、マクロファージ及び樹状細胞などのいくつかの異なる細胞型は、この機能を実行するために提案されています。しかし、DCのCD8α 順位サブセットマウスiNKT細胞13およびCD8 T細胞の14の糖脂質媒介性クロスプライミングの取り込みおよび脂質抗原の提示を媒介する主要な細胞であることが実証されました。
別抗原提示細胞による抗原提示の効率を比較するためにove_content ">、直接的なアプローチは、ナイーブな宿主に抗原の等量でパルス精製APCの異なる種類を転送することである。このタイプの細胞移入実験は、多くの場合、免疫学的研究のために行われます。これらの細胞は、それらが全細胞15の2％未満を構成しているリンパ器官のような稀な集団が存在しかし、 エクスビボ抗原処理されたDCと転写研究を行うことは、困難である。ドナー動物におけるこれらの細胞の発達を強化することが必要です分離プロトコルの効率を増加させます。それは、共通のpDC、CD8 POSおよびCD8 Negの DCサブセットの生成に必要とされるリンパ系および骨髄系共通前駆細胞、明示FMS関連受容体チロシンキナーゼ3（FLT-3）ことが知られています。 in vivoでのFlt-3リガンド（FLT-3L）投与、emigrat時に骨髄からのFlt-3を発現する前駆細胞のイオンは、末梢リンパ器官の増加播種およびそれらの成熟DCの子孫16の膨張を生じ、増加されます。 FLT-3の発現はB、TまたはNK細胞の分化経路へのコミットメントの間に失われます。したがって、最小限の変更は、FLT-3Lの投与の際に、これらの細胞で観察されます。 DC集団において同様の拡大はFLT-3L 17,18の持続的な全身レベルを提供するための簡単で経済的な方法を提供するマウスのFlt-3Lを、分泌B16メラノーマ細胞株の注入によって生成された腫瘍を有するマウスで観察されます。このアプローチを使用して、我々は大幅その後の実験のために単離することができ、これらの細胞の収量を増加させる、マウス脾臓中のすべての通常のDCサブセットの拡大を刺激するのFlt-3Lを分泌B16黒色腫細胞の移植に基づくプロトコルを開発しました。 14日間皮下イムを次の – 私たちは常に10内にいることを見つけます総脾臓細胞の60％ – FLT-3分泌腫瘍のプランテーションは、マウス40を構成するDCの著しい富化と脾腫発症します。これらの脾臓から、異なるDCサブセットは、サブセット特異的な表現型マーカーを用いる標準的な市販の細胞精製キットを用いて高純度で単離することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
樹状細胞は、T細胞応答のプライミングに関与する細胞を提示する主要なプロフェッショナル抗原であることが受け入れられています。彼らの主な機能は、T細胞に提示するための抗原を取り込み、処理することにより、組織微小環境を調査することです。特定のDCサブセットの機能を研究するために、これらは、それらの正常な表現型および機能を維持する方法を使用して、十分な数の単離す…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究はアインシュタインがんセンター（NIH / NCI CA013330）とエイズ研究センター（NIH / NIAID AI51519）でサポートされているFACSコア設備を用いて実施したサイトメトリーこの作品は、SAPの流れにNIH / NIAIDの助成金AI45889によってサポートされていました。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al. ,2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media | |||
| 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer: | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000- |
2,000 Units of collagenase activity per ml This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use |
Referências
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