En effektiv og High Yield metode for isolering av mus dendrittiske cellen Delsett

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Dendrittiske celler (DCS) er profesjonell antigen-presenterende celler som først og fremst er ansvarlig for å anskaffe, bearbeide og presentere antigener på antigen-presenterende molekyler for å igangsette T-celle-mediert immunitet. Dendrittiske celler kan deles inn i flere fenotypisk og funksjonelt heterogene undergrupper. Tre viktige undergrupper av milt dendrittiske celler er plasmacytoid, CD8a ^Pos og CD8a ^Neg celler. De plasmacytoid DC er naturlige produsenter av type I interferon og er viktig for anti-virus-T-celle immunitet. Den CD8a ^Neg DC undergruppe er spesialisert for MHC klasse II antigen presentasjon og er sentralt involvert i grunning CD4 T-celler. Den CD8a ^Pos DC er primært ansvarlig for kryss-presentasjon av eksogene antigener og CD8 T-celle-grunning. De CD8a ^Pos DC har vist seg å være mest effektive i presentasjonen av glykolipidlagringsforstyrrelser antigener ved CD1d molekyler til en spesialisert T cell befolkningen kjent som invariant natural killer T (INKT) celler. Administrasjon av Flight-3 ligand øker hyppigheten av migrasjon av dendrittiske celler stamfedre fra benmarg, til slutt resulterer i utvidelse av dendrittiske celler i perifere lymfoide organer i murine modeller. Vi har tilpasset denne modellen for å rense et stort antall funksjonelle dendrittiske celler for anvendelse i celleoverførings eksperimenter for å sammenligne in vivo ferdighet av forskjellige DC-undergrupper.

Introduction

Dendrittiske celler (DC) ble oppdaget nesten førti år siden som "store stel (gresk dendron) celle" funnet i lymfoide organer ^1. Mange studier har vist at DC er de eneste antigenpresenterende celler som effektivt kan stimulere naive T-celler ^2. En viktig funksjon av disse cellene er opptak og presentasjon av antigener og deres effektiv behandling og lasting av disse på antigenpresenterende molekyler. I mus milt, kan DC separeres i plasmacytoid og konvensjonelle undergrupper. De plasmacytoid DC er preget av lav uttrykk for CD11c og høye nivåer av B220 og Gr-1. De er også positivt for overflaten markør mPDCA1 og skiller type I interferon som svar på bompenger som reseptor 9 (TLR9) ligander. Den konvensjonelle DC er høy for CD11c og MHC klasse II uttrykk. De kan deles i tre atskilte undergrupper basert på overflaten ekspresjon av fenotypiske markører slik som CD4, CD8a, DEC205, CD11b og dendrittiske cellen hemmende reseptor 2 (DCIR2, anerkjent av 33D1 antistoff) proteiner ^3,4. De CD8a ^Pos DC er også kjent som cDC1, er positivt for DEC205, men negativt for myeloide markører som CD11b og 33D1. Den CD8a ^Neg DC, også kalt cDC2, er positive for 33D1, CD11b og CD4 men mangler DEC205. Den doble negative undergruppe (dvs. negativ for både CD4 og CD8a) er relativt sjeldne, og er negativ for DEC205 og 33D1. Det er den minst karakterisert undergruppe og kan være en mindre differensiert form av CD8a ^Neg DC.

Fenotypiske forskjeller i de forskjellige undergrupper DC også strekke seg til deres in vivo funksjoner. Den CD8a ^Neg DC er meget fagocytisk og antas å presentere eksogent antigen hovedsakelig via MHC-klasse II til CD4 T-celler ^3. I motsetning til dette CD8a ^Pos DC er spesialisert for presentasjon av oppløselig protein antigen på MHC klasse Ii en mekanisme som kalles cross-presentasjon. Utfallet av kryss-presentasjon er avhengig av aktiveringsstatusen av disse DC ^5, og kan enten føre til ekspansjon av cytotoksiske T-celler (CTL) eller utvikling av regulatoriske T-celler ^{6 2,7.} Målretting av antigen til CD8a ^Pos DC bruker anti-DEC205-antistoff-mediert leveringsresultater i stor grad i sletting av T-celler ^8, mens presentasjon av antigener avledet fra infiserte apoptotiske celler induserer en sterk CTL respons ^9.

I tillegg til erkjennelse av peptidantigener, har pattedyrimmunsystem utviklet til å gjenkjenne lipid og glykolipid-antigener. Disse antigener er presentert av CD1-molekyler, som er MHC klasse I-liknende celleoverflateproteiner som finnes i flere beslektede former i forskjellige pattedyr. I mus, en enkelt type av sterkt konservert CD1 molekyl kalt CD1d er ansvarlig for presentasjon av glykolipid-antigener ^10. Majoren populasjon av T-celler som gjenkjenner CD1d / glykolipidlagringsforstyrrelser komplekser kalles invariante NKT-celler (INKT celler). Disse cellene uttrykker en semi-invariant T-celle reseptor (TCR) består av en invariant TCRα kjede som er sammenkoblet med TCRβ kjedene som har begrenset mangfold ^11. I motsetning til konvensjonelle T-celler som trenger å spre og differensiere til å bli aktiverte effektor T-celler, INKT celler eksistere som en effektor befolkning og begynne å reagere raskt etter Glykolipidet administrasjon ^12. Identifisering av fysiologisk relevant lipid antigenpresenterende celler, er et aktivt forskningsområde, og flere forskjellige celletyper, for eksempel B-celler, makrofager og DCS er blitt foreslått for å utføre denne funksjonen. Imidlertid ble det vist at den CD8a ^Pos undergruppe av DC er den primære cellen som medierer opptak og presentasjon av antigener til lipid mus INKT celler ¹³ og glycolipid-formidlet kryss priming av CD8 T-celler ^14.

ove_content "> For å sammenligne effektiviteten av antigenpresentasjon ved forskjellige antigenpresenterende celler, er en grei måte for å overføre forskjellige typer av renset APC pulsert med ekvivalente mengder av antigen i naive verter. Cell overførings eksperimenter av denne art er ofte utført for immunologiske studier. imidlertid utfører overføringsstudier med ex vivo antigen-behandlede DC er vanskelig, siden disse cellene eksistere som sjeldne populasjoner i lymfoide organer hvor de utgjør mindre enn 2% av totale celler ^15. det er derfor nødvendig å forbedre utviklingen av disse celler i donordyrene for å øke effektiviteten av isolerings protokoller.

Det er kjent at den felles lymfoid og felles myeloide stamceller, som er nødvendig for generering av PDC, CD8 ^Pos og CD8 ^Neg DC undergrupper, hurtig FMS-relaterte reseptortyrosinkinasehemming 3 (Flt-3). Ved in vivo Flt-3 ligand (Flt-3L) administrasjon, utvanion av Flt-3-uttrykkende stamceller fra benmarg blir øket, noe som resulterer i økt såing av perifere lymfoide organer og utvidelse av deres modne DC avkom ^16. Expression of Flight-3 er tapt under forpliktelse til B, T eller NK-celle differensiering veier. Derfor er det bare minimale endringer observert i disse cellene ved Flt-3L administrasjon. Tilsvarende utvidelse i DC-populasjonene er observert hos mus som har svulster som er generert av implantasjon av et B16-melanom-cellelinje som utskiller muse-Flt-3L, som gir en enkel og økonomisk metode for å tilveiebringe vedvarende systemiske nivåer av Flt-3L ^17,18. Ved bruk av denne tilnærmingen, har vi utviklet en protokoll basert på implantasjon av B16-melanomceller som utskiller Flt-3L til å stimulere ekspansjonen av alle normale DC undergrupper i musemilt, og dermed i stor grad øke utbyttene av disse cellene som kan bli isolert for etterfølgende eksperimenter . Vi finner stadig at innen 10 – 14 dager etter subkutan implantasje av Flight-3 sekresjon svulst, mus utvikler splenomegali med markert berikelse av DC til å utgjøre 40 – 60% av totale miltceller. Fra disse milt, kan forskjellige DC undergrupper isoleres med høy renhet ved hjelp av standard kommersielt tilgjengelige celle rensing kits som benytter undergruppe spesifikke fenotypiske markører.

Protocol

Dyreforsøk er gjort i henhold til vedtatte retningslinjer fra institusjonelle Animal Care og bruk komité (IACUC). Alle prosedyrer som krever sterilitet er utført i et biosikkerhet skap. 1. Implantasjon av B16.Flt3L Melanom i Mus Kultur den Flt-3-uttrykkende B16 melanomcellelinjen T25 i vevskulturflasker med en tetthet på 0,5 x 10 6 celler / ml i komplett DMEM-medium med 10% CO2 ved 37 ° C. Vokse til cellene når ~ 90% samløpet (~ 20 timer). H?…

Representative Results

Utfallet av denne prosedyren er avhengig av utvidelse av DC undergrupper av muse Flt-3L uttrykt av de implanterte melanomceller. Den B16.Flt3L tumor ble avledet fra en C57BL / 6 mus, og bør implanteres i dyr med at stamme bakgrunn for å unngå svikt i svulsten til å etablere seg på grunn av avvisning. I noen tilfeller kan det være ønskelig å anvende genetisk modifiserte mus for å utlede DC med kjente feil i signalveier eller reseptorer av interesse. Det er viktig å huske på at …

Discussion

Dendrittiske celler er akseptert å være den viktigste profesjonell antigen-presenterende celler som er involvert i priming av T-celle-responser. Deres viktigste funksjon er å kartlegge vevet mikromiljøet ved å ta opp og behandle antigener for presentasjon til T-celler. For å studere funksjonen av spesifikke DC undergrupper, må disse isoleres i tilstrekkelig antall ved hjelp av en fremgangsmåte som opprettholder sin normal fenotype og funksjoner. De fleste protokoller er avhengige av isoleringen av spesifikke und…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al. ,2000
Serum free DMEM and RPMI media
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)     5 ml HEPES Buffer (1 M)     5 ml L-glutamine (200 mM)  0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.  Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer:			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-			2,000 Units of collagenase activity per ml This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use