Metoder för att upptäcka alternativa Promoter Användning och transkriptionsreglering av murin Bcrp1
Summary
Med mus ABC-transport Bcrp1 (ABCG2) som ett exempel, in silico-protokoll presenteras för att upptäcka alternativa promotor användning i gener som uttrycks i mus vävnader, och att utvärdera funktionaliteten av de alternativa promotorer identifieras med hjälp av reporteranalyser.
Abstract
Genuttryck i olika vävnader ofta styrs av alternativa promotorer som resulterar i syntesen av mRNA med unika – vanligtvis oöversatta – första exonerna. Bcrp1 (ABCG2), den murina ortologen av ABC-transport Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), har åtminstone fyra alternativa promotorer som betecknas med motsvarande fyra alternativa första exoner produceras: E1U, E1A, E1B och E1C. Häri in silico protokoll presenteras för att förutsäga alternativ promotor användning för Bcrp1. Vidare är reporteranalysförfaranden beskrivs för att producera reporterkonstruktioner för alternativa promotorer och för att bestämma funktionaliteten av förmodade promotorer uppströms om de alternativa första exonerna som identifieras.
Introduction
Mer än hälften av mänskliga gener regleras av alternativa promotorer 1. Varje alternativ promotor kan innehålla regulatoriska element som kan skilja sig från dem i andra alternativa promotorer. Promotorn (er) utnyttjas i en vävnad kan skilja sig från dem som används i en annan vävnad. Till exempel, är det möjligt att aktivering av en viss signalväg kan utlösa den alternativa promotorn för en gen som utnyttjas i en vävnad, men har ingen effekt på eller undertrycka ett separat alternativ promotor för samma gen som utnyttjas i en annan vävnad.
Expression av Bcrp1 genen regleras av alternativa promotorer. Bcrp1 är den murina ortologen av den mänskliga bröstcancerresistensprotein (BCRP) genen. BCRP är en ATP-bindande kassett (ABC) transportör, formellt utsedda ABCG2 2, 3. Som en apikala plasmamembranprotein, till BCRP / Bcrp1 funktioner utflödet ett brett utbud av naturliga och xenobiotiska substrat <sup> 3, 4. Hos människor och möss är BCRP / Bcrp1 starkt uttryckt i farmakologiskt relevanta organ såsom lever (gallcanaliculi), tarm och njure, samt organ med blod-vävnadsbarriärer såsom placenta, hjärna och testis 2, 5-12. Expression av BCRP / Bcrp1 i hematopoetisk och andra stamceller, inklusive cancerstamceller, kan resistens hos dessa celler att xenobiotika och cancer kemoterapeutiska läkemedel 3.
I början av arbetet med att förstå regleringen av BCRP uttryck i normala och neoplastiska celler, 5 'snabb förstärkning av cDNA-ändar (5'-RACE) analys av BCRP-mRNA för att bestämma dess exakta transkriptionsstartsätet 13. Inte bara fanns flera transkriptionsstartställen har hittats; också stött var tre alternativa former av det första exonet, som i BCRP är oöversatt. Dessa alternativa första exoner – Speciellt E1a, E1b, E1C – uttrycktes på olika sätt i en mängd av mänskliga vävnader. Ytterligare två första exon varianter upptäcktes i en BLAST-sökning av den mänskliga EST-databasen med hjälp av andra exon av BCRP 13. Fyra matcher avslöjade en första exonet> 70 kb uppströms från exon 2 som betecknades E1u; fyra andra matcher visade BCRP mRNA som saknade en första exon helt, vilket betecknades E1- 13. Närvaron av alternativa ledar exoner anses vara en manifestation av alternativ promotoranvändning 14.
Hos möss, fyra alternativa första exonerna i Bcrp1 beskrivs som kan motsvara alternativa promotorer som styr BCRP pt transkription i olika mus vävnader; dessa exoner / promotorer betecknas E1U, E1A, E1B och E1C, och är belägna ca 70, 58, 15, och 5 kb uppströms från Bcrp1 exon 2 5, 15. E1A mRNA isoform befanns vara dominerande i Murine hematopoetiska stamceller, hjärta, lunga, mjälte och hjärna, medan E1B isoformen uttrycktes i mus tarmen, fetala leverceller, och erytroida prekursorceller i benmärg 5, 15. Promotorn uppströms från E1B visades vara den huvudsakliga alternativa promotorn styr Bcrp1 transkription i mus tarmen, regleras åtminstone delvis, genom fosfo-cyklisk-AMP-svarselement-bindande protein (p-CREB) och ett CREB responselement som är unik för att alternativa Bcrp1 promotorn 16. Den E1C mRNA isoform huvudsakligen uttrycks i vuxen mus lever och njure 5. Den E1U isoformen är omöjligt att spåra i de flesta vävnader testades med undantag för mus testiklar, där det är den dominerande isoform uttryckt 5. Bcrp1 uttryckt i rått testiklarna finns i både somatiska (endotelceller tight junctions, peritubulära myoid celler och Sertoliceller) och könsceller (i sädeskanalens endotel, där det kan skydda slutskedet spermatider 4). region uppströms från E1U innehåller en funktionell respons element för steroidogena faktor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA och protein markant reducerad i testiklarna av Sertoli cellspecifika SF-1 knockoutmöss, vilket tyder på att Bcrp1 uttryck i murina Sertoliceller styrs av SF-1 5.
De protokoll som presenteras i detalj metoder för att upptäcka alternativa första exonerna i Bcrp1 in silico, och att upprätta luciferas baserade reporter analyser för förmodade promotorer uppströms från de alternativa första exonerna identifierats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Majoriteten av de metoder och representativa resultat som presenteras beskrivs i tidigare verk med titeln "B crp1 transkription i mus testiklar styrs av en promotor uppströms om en ny första exon (E1U) regleras av steroidogena faktor-1", som publicerades i 2013 5 . Utöver de representativa resultat avbildas här, tidigare Latrin uppskattningar av alternativ första exon utnyttjandet med hjälp av 5'-RACE-PCR och RT-PCR-metodik. Vidare in silico identifiering av en förmodad …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Merit Review Awards till Douglas D. Ross och till Arif Hussain från Department of Veterans 'Affairs.
Materials
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep – isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
Referências
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis–an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer’s brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5′ untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Promega. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System – INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. . Quick Ligation Kit Protocol – M2200S. , (2014).
- Roche. . XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol – Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. . Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
