В Vivo щелочной Comet Assay и энзим-модифицированной щелочной Comet Анализ для Измерение разрывов ДНК и окислительный ДНК повреждений в печени крысы
Summary
The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.
Abstract
Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.
Introduction
Щелочной метод ДНК-комет измеряет разрывы ДНК на уровне одной клетки. Суспензии отдельных клеток встроены в агарозном на предметное стекло микроскопа и клетки лизируют с образованием нуклеоиды, которые содержат суперспирализована петли ДНК. Электрофорез при рН> 13 приводит к потере суперспирализации в петлях ДНК, содержащих разрывы цепи, с освобожденными нитями ДНК мигрирующие к аноду, создавая кометоподобное структур, которые можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Фрагментированной ДНК мигрирует из «головы» кометы в «хвост» , на основании размера фрагмента и относительной флуоресценции кометного хвоста по сравнению с полной интенсивностью (голова и хвост) могут быть использованы для количественного определения ДНК поломки 1 , 2. Анализ прост, чувствительный, универсальный, быстрый и относительно недорогой 1. Обнаружение фрагментированной ДНК, вызванное повреждающих ДНК агентов использовали анализ для количественной оценки повреждения ДНК в клетках или изолированных ядер от IndiviДвойные ткани животных, обработанных с потенциально генотоксическому материала (ов). Благодаря своим преимуществам, анализ кометы в естественных условиях рекомендуется в качестве второго естественных условиях генотоксичности анализа в (спаренной с в естественных условиях микроядер анализа) для проведения оценки безопасности продукции в текущей Международной конференции по гармонизации (ICH) 3 и Европейский орган по безопасности пищевых продуктов (EFSA ) 4 нормативным требованиям. В нашей лаборатории, мы использовали анализ для оценки в естественных условиях повреждения ДНК , вызванного пищевых ингредиентов, фармацевтических препаратов и наноматериалов 5-10. Печени крысы, будет использоваться в качестве примера в данном протоколе, но кометы анализ может быть выполнен с другими тканей / органов экспериментальных животных, пока могут быть выделены из тканей интактных одиночных клеток.
Определенные типы повреждений ДНК трудно обнаружить, как разрывы ДНК пряди, не изменяя основной щелочной кометы анализа. В случае окислительного повреждения ДНК, прядь бreaks могут быть созданы при окислительных повреждений в ДНК перевариванием с ремонтными ферментами , такими как человека 8-оксогуанин-ДНК-N-гликозилаза 1 (hOGG1, что создает разрывы в 8-оксогуанина (8-oxoGua) и метил-fapy-гуанин 11. Кроме того , эндонуклеаза III (эндо – III) создает разрывы в основном в окисленных пиримидинов 1. Таким образом, добавление стадии ферментного расщепления делает пробирной специфический и чувствительный способ измерения окислительного повреждения ДНК в естественных условиях 12. при использовании этих анализов, мы показали , ядовито-индуцированного повреждения окислительного ДНК в печени крыс и мышей 6-8 и в сердце крыс 10.
Щелочную комет имеет множество применений в генетической токсикологии и биомониторинга человека: 1) в порядке выполнения в анализе естественных условиях для генотоксинов , определенных чувствительными в пробирке тесты 3,13, 2) для оценки механизмов ксенобиотиков-индуцированного повреждения ДНК во многих тканях 14, 3) , если исследоватьканцерогеном работает с использованием генотоксичен или не-генотоксическую способ действия (МОА) 7, 4) для оценки повреждения ДНК ремонт 15, 5) для изучения заболеваний человека и профессионального облучения 16 и 6) в качестве потенциального скринингового анализа с высокой пропускной способностью для органоспецифический генотоксичность 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает одновременное измерение прямого и окислительного повреждения ДНК в печени крыс на уровне одной клетки. Общий протокол применим к любой ткани , из которой отдельные клетки или ядра могут быть изолированы с минимальным повреждением ДНК обработки индуцированный …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
Materials
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels, (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1000 |
Referências
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the ‘comet’ assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
