Isolering og Kanylering af cerebral Parenkymalt arterioler
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
Intracerebral parenkymalt arterioler (BB), som omfatter parenkymalt arterioler, gennemtrængende arterioler og præ-kapillær arterioler, er høje modstand blodkar forgrener sig ud fra pial arterier og arterioler og dykning i hjerneparenkymet. Individuel PA perfundere en diskret cylindrisk område parenchym og neuroner i den. Disse arterioler er en central aktør i reguleringen af cerebral blodgennemstrømning både globalt (cerebrovaskulær autoregulering) og lokalt (funktionel hyperæmi). PA'er er en del af neurovaskulær enhed, en struktur, der matcher regional blodgennemstrømning til metabolisk aktivitet i hjernen og omfatter også neuroner, interneuroner og astrocytter. Perfusion gennem PAs er direkte forbundet med aktiviteten af neuroner i det pågældende område og stigninger i neuronal stofskifte fører til en forøgelse i lokal perfusion forårsaget af dilation af foderet PA. Regulering af PA'er afviger fra bedre karakteriseretpial arterier. Tryk vasokonstriktion er større i Pas og vasodilatoriske mekanismer variere. Hertil kommer, at PAs ikke modtage ydre innervation fra perivaskulære nerver – innervation er iboende og indirekte i naturen gennem kontakt med astrocytisk endfeet. Således ikke data vedrørende kontraktile regulering akkumuleret ved undersøgelser med anvendelse pial arterier ikke direkte oversætte til forståelsen PA funktion. Endvidere er det fortsat uafklaret, hvordan patologiske tilstande, såsom hypertension og diabetes, påvirker PA struktur og reaktivitet. Denne viden hul er til dels en konsekvens af de tekniske vanskeligheder vedrørende PA isolation og kanylering. I dette manuskript præsenterer vi en protokol til isolering og kanylering af gnavere PAs. Yderligere viser vi eksempler på eksperimenter, der kan udføres med disse arterioler, herunder agonist-induceret konstriktion og myogene reaktivitet. Selv er fokus for dette manuskript på PA kanylering og pres myography, isolerede PAs kan også anvendes til biokemiske, biofysiske, molekylære, og billeddannende undersøgelser.
Introduction
Den cerebrale cirkulation er unikt organiseret til at understøtte de metaboliske krav centrale neuroner, celler, der har begrænset energi butikker og er derfor meget følsomme over for ændringer i oxygentryk og levering af de nødvendige næringsstoffer. Som særlige neuronale delpopulationer bliver aktiv, når specifikke opgaver udføres, vaskulaturen fremmer en meget lokal stigning i perfusion at forhindre lokal hypoxi og nedbrydning af næringsstoffer 1. Dette er en form for funktionel hyperæmi kendt som neurovaskulære kobling, og er afhængig af den korrekte funktion af den neurovaskulær enhed, der består af aktive neuroner, astrocytter og cerebrale arterier 2. Intracerebral parenchymale arterioler, en gruppe af blodkar, der omfatter parenkymatisk, gennemtrængende og præ-kapillær arterioler, er centralt vigtige for denne reaktion, og det er så vigtigt at studere dem enkeltvis for at undersøge neurovaskulær kobling 3.
<p class = "jove_content"> parenchymal arterioler er små (20 – 70 um indvendig diameter) med høj modstand blodkar, perfundere særskilte neuronale populationer i hjernen. Forgrener sig ud fra pial arterier på overfladen, parenchymale arterioler trænge ind i hjernen parenkym på en næsten 90 ᵒ vinkel til foder undergrunden mikrocirkulationen (figur 1). Disse arterioler spiller en kritisk rolle i opretholdelsen af passende perfusionstryk da de er de mest distale glat muskel-holdige fartøjer beskytter kapillærerne. I modsætning til overfladen pial cirkulation, parenchymale arterioler mangler sikkerhed grene og anastomoser, og følgelig er "flaskehalse" af cerebral cirkulation 4. Som et resultat, dysfunktion af parenchymale arterioler bidrager til udviklingen af cerebrovaskulære sygdomme, såsom vaskulær kognitiv svækkelse og små iskæmisk slagtilfælde (også kendt som tavse eller lakunære slagtilfælde). Undersøgelser indicate at parenchymale arterioler dysfunktion kan induceres ved essentiel hypertension 5, kronisk stress 6, og er en tidlig begivenhed i små kar sygdom genetisk musemodel 7. Endvidere eksperimentelt induceret okklusion af enkelte gennemtrængende arterioler i rotter er tilstrækkelig til at forårsage små iskæmiske slagtilfælde, som er cylindrisk i form, svarende dem observeret hos ældre mennesker 8.Ud over disse anatomiske forskelle, mekanismer, der regulerer kontraktionsfunktion forskellige mellem pial arterier og parenchymale arterioler. Myogene vasokonstriktion er større i parenkymale arterioler 9, muligvis på grund af manglen på ydre innervation 10, distinkte former for mechanotransduction 11, og forskelle i intracellulær Ca2 + signalering 12,13 i vaskulære glatte muskelceller. Noget tyder på, at endotel-afhængige vasodilaterende mekanismer også variere mellem disse vascunende segmenter, med parenkymale arterier udviser større afhængighed af mekanismer, der involverer Ca2 + -aktiverede K + kanaler og electrotonic kommunikation inden for karvæggen sammenlignet med diffunderbare faktorer såsom nitrogenoxid og prostacycliner 14. Derfor data indsamlet i forsøg med pial arterier kan ikke nødvendigvis gælde for parenkymatisk arterioler, efterlader et hul i vores viden om lokal kontrol af cerebral perfusion.
På trods af deres betydning, parenchymale arterioler er langt under-studerede, primært på grund af de tekniske udfordringer med isolering og montering for ex vivo undersøgelse. I dette manuskript beskriver vi en metode til at isolere og kanyle cerebrale parenchymale arterioler, som kan anvendes til tryk myography, eller at isolere væv til immunolabeling, elektrofysiologi, molekylærbiologi, og biokemiske analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebral parenkymalt arterioler er høje modstand arterioler med få anastomoser og grene, der perfundere forskellige neuronale populationer. Disse specialiserede blodkar er centrale aktører i cerebrovaskulær autoregulering og neurovaskulær kobling gennem astrocyt-medieret vasodilatation 1. Betydningen af disse specialiserede blodkar i cerebral vaskulær sygdom har været kendt i ca. 50 år, hvor pionerarbejde Dr. Miller Fisher beskrevet strukturelle ændringer i parenkymale arterioler inden for de område…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
Referências
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer’s disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
