トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性
Summary
DNAアセンブリを使用して、複数のCRISPRベクトルが単一クローニング反応に並列に構築することができ、CRISPR多数の構造を作ることは簡単な作業ベクトル。トマト毛状根は、CRISPRベクトルを検証し、突然変異体材料を生成するための優れたモデルシステムです。
Abstract
Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.
Introduction
CRISPR / Cas9で標的DNAの変更を生成する能力は、機能的ゲノム研究のための大きな可能性を秘めています。 CRISPR / Cas9システムの2つのコンポーネントがあります。 ブドウ球菌化膿連鎖球菌と、標的DNA部位（複数可）1にCas9を指示およそ100-ntのガイドRNA（gRNA）分子に由来Cas9ヌクレアーゼ、。標的認識は、最初にによって与えられる〜ターゲティングベクター2,3の高スループット生産を可能にするgRNA、20-NT。操作することができるほとんどの生物は、既にCRISPR / Cas9技術4,5とされています。
植物では、例えば、CaMV35Sプロモーターなどの構成的プロモーターは、一般にCas9ヌクレアーゼ6の発現を駆動するために使用されます。 gRNAsはgRNAの最初の塩基を制限するRNAポリメラーゼIII U6またはU3プロモーターを用いて表現しているのいずれかG、効率的な転写のためのU3のためのU6、またはA、のために。しかし、RNAポリメラーゼIIのプロムこれらの制限のないotersも、7,8を使用されています。
異なるgRNAsは異なる効率を有するDNAの突然変異を誘発し、最初に全植物の形質転換に投資するか、大規模な表現型の画面を設定する前に、CRISPRベクトルを検証するために重要であり得ます。植物におけるCRISPRコンストラクトの一過性発現は、例えば、アグロインフィルトレーションを使用して、一般的なアプローチでは非実用的変異の検出が困難と表現型のアッセイを行うこと、安定した植物体6と比較して、DNA修飾の低い周波数になります。いわゆる毛状根は、安定した植物についてヶ月とは対照的に独立した、安定に形質転換された材料の多くは、数週間以内に発生させることができるので便利で、代替システムです。 CRISPRベクターは、毛状根9,10においてDNA突然変異を誘発するのに非常に効果的です。
DNAアセンブリ方法は、効率的overlを含むDNA断片を連結しますappingは11を終了します。いくつかのDNAの組み立て方法の主な利点は、組み立てられた製品へのssDNA（ すなわち 、オリゴ）を組み込む能力です。 gRNAsのみ〜20ヌクレオチド長であり、新たなターゲットが合成オリゴを用いて作製することができるので、これらのDNAアセンブリ方法は、CRISPRクローニングに適しています。ここに記載されたプロトコルが正常に大豆10、ポプラ12で使用され、現在はトマトされたCRISPRベクトルのP201シリーズに基づいています。提示クローニング手順は、現在のクローニング法10の上にいくつかの利点を提供しています。すなわち、完全に機能的なベクターは、1日に単一クローニング反応で生成することができます。ベクター構築はさらに手をオン還元時間と材料費、並行して複数のCRISPRベクトルを生成するためにプールすることができます。我々はまた、標的遺伝子の欠失を有するトランスジェニック材料を製造するための効率的な方法として、トマト毛状根を生成するためのプロトコルを提示します。毛状根を有効に使用されていますCRISPRベクトルを食べ、その後の実験のための材料を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes17,18, or overlap-extension PCR19. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学財団の助成金IOS-1025642（GBM）によってサポートされていました。我々はARqua1株を提供するためのマリア・ハリソンに感謝します。
Materials
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' -> 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGAAATTTATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTGAAG | ||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT | ||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTCAAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTAGATGT | ||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG | Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. | |||
Referências
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