Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
इन्फ्लुएंजा ए वायरस (IAV) hemagglutinins कोशिका की सतह पर सियालिक एसिड को पहचान के रूप में कार्य रिसेप्टर्स कोशिकाओं में प्रवेश पाने के लिए। जंगली जलपक्षी IAV के लिए प्राकृतिक जलाशय हैं, लेकिन IAV मुर्गी, सूअर, घोड़े और मनुष्य के लिए प्रजातियों बाधा पार कर सकते हैं। एवियन वायरस सियालिक एक α2-3 लिंकेज (एवियन प्रकार रिसेप्टर्स) द्वारा एक अंत से पहले गैलेक्टोज से जुड़ी है, जबकि मानव वायरस रियायत के तौर पर एक α2-6 उठाना (मानव-प्रकार रिसेप्टर्स) के साथ सियालिक एसिड को पहचान एसिड को पहचानते हैं। एवियन वायरस मानव प्रकार रिसेप्टर्स के लिए अनुकूल हैं, तो नजर रखने के लिए, कई तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है। सिंथेटिक sialosides की विभिन्न पुस्तकालयों के साथ glycan प्रोटीन तेजी से रिसेप्टर विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि, इस तकनीक avidities को मापने के लिए इस्तेमाल नहीं किया है। उत्सुकता का मापन आम तौर पर क्रमानुसार पतला hemagglutinin या वायरस के बंधन का मूल्यांकन पारंपरिक polypropylene 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए adsorbed ग्लाइकान करने से हासिल की है। इस परख में, α साथ ग्लाइकान2-3 या α2-6 सियालिक एसिड बायोटिन करने के लिए मिलकर कर रहे हैं और streptavidin प्लेटों के लिए adsorbed, या polyacrylamide (PAA) जो सीधे प्लास्टिक को सोखना करने के लिए मिलकर कर रहे हैं। हम काफी सीधे सूक्ष्म अच्छी तरह से गिलास स्लाइड पर PAA से जुड़े sialosides और उनके गैर PAA से जुड़े समकक्षों मुद्रण द्वारा इस परख छोटी है। यह सेट-अप, एक एकल स्लाइड पर 48 सरणियों के साथ, 6 glycan 8 dilutions में प्रोटीन बंधन, दो गैर-sialylated नियंत्रण सहित 6 अलग ग्लाइकान, पूछताछ के एक साथ assays के लिए सक्षम बनाता है। इस पारंपरिक प्लेट परख में 18x 96 अच्छी तरह प्लेटें के बराबर है। glycan सरणी प्रारूप यौगिकों और बायोलॉजिकल की खपत कम हो जाती है और इस प्रकार बहुत क्षमता को बढ़ाता है।
जंगली जलपक्षी IAV के लिए प्राकृतिक जलाशय हैं, लेकिन IAV मुर्गी और सहित, मनुष्य स्तनधारियों के लिए प्रजातियों बाधा पार करने में सक्षम है। एवियन IAVS, α2-3 जुड़े सियालिक एसिड (एवियन प्रकार रिसेप्टर्स) समझते हैं जबकि मानव वायरस α2-6 जुड़े सियालिक एसिड (मानव-प्रकार रिसेप्टर्स) बाँध। कुशलता से दोहराने के लिए और मनुष्य एक एवियन IAV मानव-प्रकार रिसेप्टर्स 1 के लिए बाध्य करने की जरूरत के बीच संचारित करने में सक्षम होने के लिए।
IAVS सीरम विज्ञान है कि उनके hemagglutinin (हेक्टेयर) और neuraminidase (एनए) लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के प्रतिजनकता की विशेषता के आधार पर विभाजित हैं। हा, सियालिक एसिड को बांधता है, जबकि NA वायरल जीवन चक्र और cleaves सियालिक एसिड 2 के दूसरे छोर पर रिसेप्टर को नष्ट करने एंजाइम है। H1N1, H2N2 और H3N2 सहित सभी मानव को संक्रमित वायरस, एक एवियन मूल 3 लोगों की है। दशकों से अधिक समय मानव क्रॉसओवर करने के लिए कई एवियन के अंतिम दो H5N1, H7N7, H7N9 और साथ हुआ है सबसे अच्छी तरह से जाना जा रहा है; होवेदेखें, अन्य उपप्रकार अधिक कई मायनों मनुष्यों को संक्रमित है (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4। सौभाग्य से, ऐसा लगता है कि ये वायरस से कोई भी पूरी तरह से मानव-प्रकार α2-6 से जुड़े सियालिक एसिड रिसेप्टर्स 5-8 के लिए अनुकूल करने में सक्षम है। एवियन वायरस या अन्य जूनोटिक के अनुकूलन मानव मेजबान टीम में प्रतिकृति और ट्रांसमिशन समायोजित करने के लिए मानव स्वास्थ्य पर एक विनाशकारी प्रभाव हो सकता है। इसलिए, कैसे ये वायरस मानव-प्रकार रिसेप्टर्स के लिए बाध्य करने के लिए उभरते इन्फ्लूएंजा वायरस के दुनिया भर में व्यापक निगरानी में मदद मिलेगी विकसित हो रहे हैं के पूर्व ज्ञान।
रिसेप्टर वरीयता का निर्धारण पहले विभिन्न प्रजातियों के एरिथ्रोसाइट्स का उपयोग कर elucidated और फ्लू के शोधकर्ताओं ने 9-12 के बीच एक इष्ट परख रहता था। प्रदर्शन है कि एवियन वायरस को पहचान α2-3 सियालिक एसिड और मानव वायरस α2-6 सियालिक एसिड से जुड़े मूल रूप से एक परख एरिथ्रोसाइट्स enzymatically ली से प्रत्येक को शामिल करने के लिए इंजीनियर की hemagglutination के प्रयोग पर आधारित था13,14 nkages। हालांकि readout hemagglutination, virologists के लिए एक मानक परख है, अंतर्निहित glycan संरचनाओं परिभाषित नहीं कर रहे हैं, केवल टर्मिनल लिंकेज। इसके अतिरिक्त, sialyltransferases, कोशिकाओं को फिर से sialylate करने के लिए इस्तेमाल की सीमित उपलब्धता, इस परख 15-18 का उपयोग सीमित है। बाद में, रिसेप्टर बाध्यकारी वरीयताओं का निर्धारण करने के अन्य तरीकों sialylated glycan प्लेट आधारित assays 19,20 में पाली एक्रिलामाइड (PAA) या पाली ग्लूटामेट (पीजीए) संरचनाओं से जुड़े संरचनाओं का उपयोग शुरू किए गए थे। कई रूपों microtiter प्लेटें, जिनमें से प्रत्येक का एक मजबूत, विश्वसनीय और बहुत ही संवेदनशील एलिसा प्रकार परख 21-23 में परिणाम के लिए कोटिंग या तो ग्लाइकान या वायरस में संभव हो रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, बायोटिन से जुड़े ग्लाइकान PAA / पीजीए जगह ले सकता है और streptavidin में लिपटे प्लेटों 2,24 संयुग्मित जा सकता है। हालांकि कुछ विशिष्ट सीरा आवश्यक हो सकता है, ELISAs मानक और कई PAA से जुड़े ग्लाइकान कर रहे हैं आसानी से commerciallY और गैर-व्यावसायिक रूप से उपलब्ध (कार्यात्मक Glycomics के लिए कंसोर्टियम (http://www.functionalglycomics.org))।
Glycan माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी, रिसेप्टर विशिष्टता निर्धारित करने के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में उभरा है के रूप में कई अलग अलग ग्लाइकान देखा जाता है, और विभिन्न संरचनाओं की एक विस्तृत सरणी के लिए बाध्य एक भी परख 25-29 के भीतर मूल्यांकन किया जा सकता है। इन संरचनाओं को IAV के बंधन glycan संरचनाओं कि IAV रियायत के तौर पर 30-33 पहचानता का एक बेहतर समझ प्रदान करता है। Glycan प्रोटीन एक बाध्यकारी परख प्रदर्शन करने के लिए नमूना मात्रा की छोटी मात्रा में आवश्यकता होती है और केवल स्थान (2 NL) प्रति glycan की मात्रा मिनट उपयोग करता है। हालांकि, इन सरणियों आम तौर पर ग्लाइकान रिसेप्टर्स की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए ही किया जाता है। कई वायरस, या hemagglutinin प्रोटीन, कई एकाग्रता पर्वतमाला में से विश्लेषण की आवश्यकता स्लाइड्स की संख्या की वजह से निषेधात्मक हो सकता है। इसके अलावा, आज तक, कोई रिश्तेदार उत्सुकता परख glycan की गिरफ्तारी का उपयोग कर विकसित किया गया हैरे तकनीक।
glycan माइक्रोएरे तकनीक और एलिसा आधारित assays में Paa से जुड़े ग्लाइकान की संवेदनशीलता द्वारा afforded कम नमूना आवश्यकता गठबंधन करने के लिए, हम के रूप में की तुलना में एक बहु अच्छी तरह से glycan सरणी है कि समान या बेहतर संकल्प के साथ उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुमति होगी विकसित करने की मांग पारंपरिक एलिसा आधारित परख करने के लिए। इसके साथ ही, हम बायोलॉजिकल और रिपोर्टर रसायन खपत की मात्रा को कम करना चाहता था। अंतिम परिणाम एक छोटी उत्सुकता परख, विशेष IAV विशिष्टता की निगरानी के लिए विकसित किया है और समान रूप से अन्य glycan बंधनकारी प्रोटीन का आकलन करने के लिए लागू है। एक गिलास स्लाइड एक Teflon मुखौटा द्वारा 48 माइक्रो कुओं में अलग प्रयोग, 6 अलग ग्लाइकान अच्छी तरह से प्रति 6 प्रतिकृति में देखा जाता है। माइक्रोएरे मंच देता है रिसेप्टर में एक ही प्रवृत्तियों कई फायदे के साथ मैक्रो एलिसा प्रारूप में देखा बंधन। ये (मैं) 6 प्रतिकृति में परिसर के मुद्रण, शामिल न्यूनतम नमूना का उपयोग कर, कई पंक्तियों की कोटिंग बनाम मैंna थाली, अच्छी तरह से प्रति 100 μl का उपयोग; (द्वितीय) कई विभिन्न यौगिकों नियंत्रण सहित एक भी अच्छी तरह से, एक साथ विश्लेषण किया; (तृतीय) ऊष्मायन मात्रा और में भारी कमी; (चतुर्थ) एक बड़ा गतिशील एक फ्लोरोसेंट readout का उपयोग कर सीमा होती है। एक एकल स्लाइड 18x 96 अच्छी तरह प्लेटें के बराबर होने की गणना की जा सकती है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल, fabricating और विश्लेषण के किसी भी प्रयोगशाला में सक्षम साथ देखा प्रोटीन इस छोटी एलिसा प्रारूप का निर्माण करने में सक्षम होना चाहिए।
आकलन IAV रिसेप्टर विशिष्टता एवियन वायरस की महामारी क्षमता का विश्लेषण करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। सियालिक एसिड मान्यता वायरस से इस तरह के बंधन और सेल से रिहाई के रूप में कई जैविक गुणों से जुड़ा हुआ है…
The authors have nothing to disclose.
इस काम के स्क्रिप्स माइक्रोएरे कोर सुविधा, और रोग नियंत्रण केंद्र (जेसीपी) से एक अनुबंध द्वारा समर्थित किया गया था। RPdV वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO) से एक फ़ैसला और VENI अनुदान के एक प्राप्तकर्ता है। कंसोर्टियम कार्यात्मक Glycomics के लिए (http://www.functionalglycomics.org/) NIGMS अनुदान GM62116 (जेसीपी) द्वारा वित्त पोषित इस अध्ययन में इस्तेमाल कई ग्लाइकान प्रदान की है। इस स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट से प्रकाशन 29113 है।
NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |