Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Influenza A virus (IAV) hæmagglutininer genkende sialinsyrer på celleoverfladen som funktionelle receptorer at få adgang til cellerne. Wild vandfugle er den naturlige reservoir for IAV, men IAV kan krydse arter barriere for fjerkræ, svin, heste og mennesker. Fuglevira genkende sialinsyre bundet til en næstsidste galactose ved en α2-3 binding (aviær receptorer) henviser humane vira genkender fortrinsvis sialinsyre med en α2-6 linkage (human-receptorer). For at overvåge, om aviær virus tilpasning til humane receptorer, kan flere metoder anvendes. Glycan mikroarrays med forskellige biblioteker af syntetiske sialosides anvendes i stigende grad til at vurdere receptor specificitet. Imidlertid er denne teknik ikke anvendes til måling aviditeter. Måling af aviditet opnås typisk ved at evaluere bindingen af seriefortyndet hæmagglutinin eller virus til glykaner adsorberet til konventionelle polypropylen 96-brønds plader. I dette assay glycaner med α2-3 eller α2-6 sialinsyrer er koblet til biotin og adsorberet til streptavidin plader, eller er koblet til polyacrylamid (PAA), som direkte adsorbere til plasten. Vi har betydeligt miniature denne analyse ved direkte udskrivning PAA-forbundne sialosides og deres ikke PAA-forbundne modparter på mikro-godt objektglas. Dette set-up, med 48 arrays på en enkelt dias, muliggør samtidige analyser af 6 glycan proteiner på 8 fortyndinger, spørgekriterierne 6 forskellige glykaner, herunder to ikke-sialylerede kontroller. Det svarer til 18x plader med 96 brønde i den traditionelle plade-assay. Den glycan arrayformat nedsætter forbruget af forbindelser og biologiske og således i høj grad forbedrer effektiviteten.
Wild vandfugle er den naturlige reservoir for IAV, men IAV er i stand til at krydse artsbarrieren til fjerkræ og pattedyr, herunder, mennesker. Avian IAVs genkender α2-3 forbundne sialinsyrer (aviær type receptorer), hvorimod human virus binder α2-6 forbundne sialinsyrer (menneske-type receptorer). At være i stand til effektivt at replikere og overføre mellem mennesker en aviær IAV behov for at binde til human-receptorer 1.
IAVs er opdelt baseret på serologi som kendetegner antigeniciteten af deres hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) kappeglycoproteiner. HA binder til sialinsyrer, hvorimod NA er den receptor-ødelæggende enzym i den anden ende af det virale livscyklus og spalter sialsyre 2. Alle menneskelige inficerende virus, herunder H1N1, H2N2 og H3N2, har en aviær oprindelse 3. I løbet af de to sidste årtier flere aviær menneskelige delefiltre har fundet sted, med H5N1, H7N7, og H7N9 er den mest kendte; however, har andre undertyper inficerede mennesker mere sporadisk (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Heldigvis ser det ud til, at ingen af disse vira har været i stand til fuldt ud at tilpasse sig til human type α2-6-linked sialinsyrereceptorer 5-8. Tilpasning af aviær eller andre zoonotiske vira til at rumme replikation og transmission i menneskelige værter kunne have en ødelæggende virkning på menneskers sundhed. Derfor forudgående viden om, hvordan disse vira udvikler sig til at binde human receptorer vil hjælpe verdensomspændende overvågning af nye influenzavira.
Bestemmelse af receptor præference blev først belyst ved hjælp af erythrocytter af forskellige arter og er stadig et yndet assay blandt influenza forskere 9-12. Påvisningen af, at aviære vira genkende α2-3 sialinsyre og menneskelige vira α2-6 knyttet sialinsyre blev oprindeligt baseret på et assay ved anvendelse hæmagglutinering af erytrocytter enzymatisk manipuleret til at indeholde hver af de linkages 13,14. Selvom udlæsning er hæmagglutinering, et standardassay for virologer, er de underliggende glykanstrukturer ikke defineret, kun det terminale binding. Derudover den begrænsede tilgængelighed af de sialyltransferaser, der anvendes til at re-sialylere cellerne, har begrænset anvendelsen af dette assay 15-18. Efterfølgende blev andre metoder til bestemmelse receptorbindende præferencer indføres ved anvendelse af sialylerede glykanstrukturer knyttet til poly-acrylamid (PAA) eller poly-glutamat (PGA) strukturer i plade-assays 19,20. Adskillige variationer er mulige i overtrækning enten glykaner eller vira til mikrotiterplader, der hver især resulterer i en robust, pålidelig og meget følsom ELISA-assay 21-23. Alternativt kan biotin-forbundne glycaner erstatte PAA / PGA og kan konjugeres til streptavidin-coatede plader 2,24. Selv om der kan kræves nogle specifikke sera, ELISA er standard og flere glykaner knyttet til PAA let commercially og ikke-kommercielt tilgængelige (Consortium for Funktionelle Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glycan microarray teknologi er dukket op som et uvurderligt værktøj til at bestemme receptor specificitet, som flere forskellige glykaner er plettet, og binding til en bred vifte af forskellige strukturer kan vurderes inden for en enkelt assay 25-29. Den binding af IAV til disse strukturer giver en bedre forståelse af de glykanstrukturer der IAV fortrinsvis genkender 30-33. Glycan mikroarrays kræver små mængder af prøvevolumen til at udføre et bindingsassay og bruger kun små mængder af glycan pr plet (2 nl). Men disse arrays typisk brugt til at evaluere specificiteten af glycaner receptorer. Analyse af flere vira eller hæmagglutinin proteiner, ved multiple koncentrationsområder kan være uoverkommelige på grund af antallet af objektglas, der kræves. Endvidere til dato ingen relativ aviditet assay er blevet udviklet ved hjælp af glycan array teknikker.
For at kombinere det lave prøve gives ved glycan microarray teknikker og følsomheden af PAA-forbundne glycaner i ELISA-baserede assays, vi søgt at udvikle en multi-brønd glycan array, der ville give mulighed for high-throughput analyse med tilsvarende eller bedre opløsning sammenlignet til den traditionelle ELISA-baseret assay. Samtidig ønskede vi at minimere mængden af biologiske og reporter kemikalier forbruges. Det endelige resultat er en miniaturiseret aviditet assay specielt udviklet til overvågning IAV specificitet og er lige så anvendelig til at vurdere andre glycan bindende proteiner. Brug af et objektglas adskilt i 48 mikro- brøndene ved en Teflon maske, er 6 forskellige glycaner spottet i 6 replikater pr brønd. Microarray platform frembyder de samme tendenser i receptorbinding ses i makro ELISA-format med flere fordele. Disse omfatter (I) trykning af forbindelse i 6 replikater, under anvendelse minimal prøve, versus overfladebehandling af flere rækker ina plade, ved hjælp af 100 pi per brønd; (II) flere forskellige forbindelser analyseres samtidigt i en enkelt brønd, herunder kontrol; (III) en massiv nedgang i inkubation volumen og; (IV) et større dynamikområde under anvendelse af en fluorescerende udlæsning. En enkelt dias kan beregnes at svare til 18x 96-brønds plader.
Med følgende protokol, enhver lab stand til fremstilling og analyse plettet mikroarrays bør kunne fremstille denne miniaturiseret ELISA-format.
Vurdering IAV receptor specificitet er et vigtigt skridt i at analysere pandemisk potentiale aviær virus. Sialinsyre genkendelse af viruset er knyttet til flere biologiske egenskaber, såsom binding til og frigivelse fra cellen. Viden om hvilke amino-syre-mutationer er nødvendige for aviær virus at opnå α2-6 bindende og krydse artsbarrieren muliggør pandemiberedskab. Adskillige assays anvendes til at bestemme receptor specificitet; Men alle har deres ulemper, herunder kun måle aviditet og ikke specificitet og <em…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet delvist af Scripps Microarray Core Facility, og en kontrakt fra Centers for Disease Control (JCP). RPdV er en modtager af en Rubicon og VENI bevilling fra Holland Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO). Konsortiet for Funktionelle Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) finansieret af NIGMS tilskud GM62116 (JCP), forudsat flere glycaner anvendt i denne undersøgelse. Dette er publikation 29113 fra The Scripps Research Institute.
NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |