Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi
Summary
Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Abstract
fonksiyonel reseptörler hücre içine giriş kazanmak için İnfluenza A virüsü (IAV) hemaglutininler hücre yüzeyinde sialik asitleri tanır. Yabani kuşları IAV için doğal rezervuar, ama IAV kümes hayvanları, domuz, at ve insanlara türler bariyerini geçebilir. Kuş virüsler insan virüsleri tercihen bir α2-6 bağlantı (insan-tipi reseptörler) ile sialik asit tanımak ise bir α2-3 bağlantı (avian tip reseptörler) tarafından sondan galaktoz bağlı sialik asit tanır. avyan virüs insan tipi reseptörlere uyum olup olmadığını izlemek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Sentetik sialosides farklı kütüphaneleri ile glikan mikroarray'ler giderek reseptör özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, bu teknik, birleşmelere ölçmek için kullanılır. avidite ölçümü tipik olarak geleneksel polipropilen 96 oyuklu plakalara adsorbe glıkanlara seri olarak seyreltilmiş hemaglutinin veya virüs bağlanmasının değerlendirilmesi ile elde edilir. a Bu deneyde, glikanlar2-3 ya α2-6 sialik asitler biyotine bağlı olan ve streptavidin plakaları, adsorbe ya da doğrudan plastik adsorbe poliakrilamid (PAA) kuple edilir edilmiştir. Biz önemli ölçüde doğrudan mikro kuyu cam slaytlar PAA-bağlantılı sialosides ve onların olmayan PAA-bağlantılı muadilleri yazdırarak bu testte küçültülmüş var. tek bir slayt üzerinde 48 dizileri ile bu set-up, 6 glıkan olmayan iki sialilatlı kontrolleri dahil olmak üzere 6 farklı glikanlar, sorguya, 8 dilüsyonlarda bağlayıcı proteinlerin aynı anda tahlilleri sağlar. Bu geleneksel plaka deneyinde 18x 96 oyuklu plakalara eşdeğerdir. glikan dizi formatında bileşikleri ve biyolojik tüketimini azaltır ve böylece büyük ölçüde verimliliği arttırır.
Introduction
Yabani kuşları IAV doğal rezervuarı vardır, ama IAV kümes hayvanları ve insanlar da dahil olmak üzere memelilerde, türün engelini geçmek edebilmektedir. İnsan virüsler α2-6 bağlantılı sialik asitleri (insan-tipi reseptörler) bağlamak oysa Kuş iAVS, α2-3 bağlantılı sialik asitleri (avian tip reseptörler) tanır. Etkin bir şekilde çoğaltılması ve avyan IAV insan tipi reseptör 1 bağlanma ihtiyacı insanlar arasında aktarabilmelidir için.
IAVS kendi hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) zarf glikoproteinler antijenliğini karakterize seroloji dayalı ayrılır. UA, viral yaşam çevrimi ve yarılır sialik asit 2 diğer ucunda reseptör imha edici enzim ise HA, sialik asitleri bağlanır. H1N1, H2N2 ve H3N2 dahil olmak üzere tüm insan bulaşmasını virüsleri, bir kuş kökeni 3 var. İnsan geçitler birkaç kuş yıllardır son iki aşkın H5N1, H7N7, H7N9 ve ile meydana gelmiş olan en iyi bilinen; however, diğer alt tipler daha düzensiz insanları enfekte olan (H6N1, H7N1, • H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Neyse ki, bu virüslerin hiçbiri tam olarak insan tipi α2-6 bağlı sialik asit reseptörleri 5-8 adapte olmuş gibi görünüyor. kuş ya da diğer zoonotik virüslerin Adaptasyon insan sağlığı üzerinde yıkıcı bir etkisi olabilir insan konaklarda çoğaltma ve iletim karşılamak için. Bu nedenle, bu virüsler ortaya çıkan grip virüslerinin dünya çapında gözetim yardımcı olacak insan tipi reseptörlere bağlanmasının gelişen nasıl ön bilgi.
Reseptör tercihi belirlenmesi ilk farklı türlerin eritrositler kullanılarak aydınlatılmıştır ve grip araştırmacılar 9-12 arasında bir tercih tahlil kalır oldu. avyan virüs α2-3 sialik asit ve sialik asit bağlantılı α2-6 insan virüsleri tanır gösterim orijinal enzimatik li her ihtiva edecek şekilde eritrositlerin hemaglutinasyonu kullanılarak bir deneyde dayalı13,14 nkages. okuma hemaglütinasyon, virologists için standart bir deney olsa da, altta yatan glıkan yapıları, sadece uç bağlantısı tanımlanmış değildir. Ayrıca, hücrelerin yeniden sialylate için kullanılan Sıyalıltransferazlar, sınırlı kullanılabilirlik, bu testte 15-18 kullanımını kısıtlamıştır. Daha sonra, reseptör bağlanma tercihleri belirleyen diğer yöntemler plaka bazlı tahlillerde 19,20 poli-akrilamid (PAA) ya da poli-glutamat (PGA) yapılarıyla bağlantılı sialilatlı glıkan yapıları kullanılarak eklenir. Çeşitli varyasyonlarının, sağlam, güvenilir ve çok hassas ELISA tipi deney 21-23 sonuçlanan, her biri mikrotitre plakaları için glikanlar veya virüs ya kaplanması mümkündür. Seçenek olarak ise, biotin bağlantılı glıkanlar PAA / PGA yerini alabilir ve streptavidin kaplı plakalar 2,24 konjuge edilebilir. bazı özel sera gerekli olabilir, ancak ELISA PAA bağlantılı standart ve çeşitli glıkanlar kolaylıkla are commercially ve olmayan piyasada mevcut (Fonksiyonel Glikomik için Konsorsiyumu (http://www.functionalglycomics.org)).
Glikan mikroarray teknolojileri çok farklı glukanlardır lekeli olarak, reseptör özgüllüğünü belirlemek için paha biçilmez bir araç olarak ortaya çıkmıştır, ve farklı yapıları geniş bir dizi bağlayıcı tek bir tahlil 25-29 içinde değerlendirilebilir. Bu yapılara IAV bağlanmasının IAV, tercihen 30-33 kabul glıkan yapılarının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Glıkan mikroarray'ler bağlayıcı tahlili gerçekleştirmek için örnek hacminin küçük miktarlarda ihtiyaç ve sadece nokta (2 nl) başına glıkanın dakika miktarda kullanır. Ancak, bu diziler genelde glukanlardır reseptörlerinin özgüllüğünü değerlendirmek için sadece kullanılır. Birden fazla konsantrasyon aralıklarında birden virüsler veya hemagglutinin proteinlerin analizi nedeniyle gerekli slaytlar sayısına engelleyici olabilir. Ayrıca, bugüne kadar, hiçbir nispi avidite tahlil glikan ar kullanılarak geliştirilmiştirışını teknikleri.
kıyasla glıkan mikrodizi teknikleri ve ELISA bazlı deneylerde PAA-bağlantılı glıkanların duyarlılık elde düşük örnek gereksinimi birleştirmek için, benzer ya da daha iyi çözünürlük ile yüksek verimli analizi için izin verecek bir çok-çukurlu glıkan dizi geliştirmeye çalıştılar geleneksel ELISA bazlı bir deney için. Aynı zamanda, biz tüketilen biyolojik ve raportör kimyasalların miktarını en aza indirmek istedik. Nihai sonuç, özellikle IAV özgüllük izlemek için geliştirilmiş bir minyatür avidite miktar tayini testinde, ve diğer glıkan bağlayıcı proteinleri değerlendirmek için de geçerlidir. Teflon maske ile 48 mikro kuyulara ayrılmış bir cam slayt kullanarak 6 farklı glukanlardır kuyu başına 6 tekrarlı fark vardır. mikroarray platformu reseptörü aynı eğilimler çeşitli avantajlara sahip makro ELISA formatında görülen bağlayıcı tanıyor. Bu çok sayıda satır kaplama, karşı minimum numune kullanılarak (I) 6 tekrar bileşiğin baskı dahil IOyuk başına 100 ul kullanılarak na plakası; (II) çok farklı bileşikler kontrolleri de dahil olmak üzere tek bir kuyuda, aynı anda analiz; (III) bir kuluçkalama hacminde ve büyük bir azalma; (IV) floresan okuma kullanarak daha büyük bir dinamik aralık. Tek bir slayt 18x 96 oyuklu plakalara denk olduğu hesaplanabilir.
Aşağıdaki protokol imalatı ve analiz herhangi bir laboratuvar özelliğine sahip mikroarray'ler bu minyatür ELISA biçimi üretmek gerekir gördü.
Protocol
Representative Results
Discussion
IAV reseptör özgüllüğünü değerlendirmek kuş virüslerinin pandemik potansiyeli analizinde önemli bir adımdır. virüs, sialik asit tanıma bu hücreden bağlanarak ve salma gibi biyolojik özellikleri ile bağlantılıdır. kuş virüsleri bağlayıcı α2-6 ulaşmak ve türlerin bariyer pandemik hazırlık sağlayan geçmek için Bilgi amino asit mutasyonları gereklidir. Çeşitli deneyler reseptör özelliklerini belirlemek için kullanılır; Ancak, tüm tersi sadece ölçüm avidite ve özgünl?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Scripps Mikroarray Core Tesisleri'nde, ve Centers for Disease Control (JCP) bir sözleşme ile kısmen desteklenmiştir. RPdV Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) bir Rubicon ve VENI hibe bir alıcı. NIGMS hibe GM62116 (JCP) tarafından finanse Konsorsiyumu Fonksiyonel Glikomik için (http://www.functionalglycomics.org/) Bu çalışmada kullanılan çeşitli glikan sağladı. Bu Scripps Araştırma Enstitüsü'nden yayın 29.113 olduğunu.
Materials
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
Referências
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, D49-D53 (2008).
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6′-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D’Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
