A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
En hidtil ukendt dissektion og optagelse teknik er beskrevet til overvågning afferente fyring fremkaldt ved mekanisk forskydning af hår i muse pinna. Teknikken er meget omkostningseffektiv og let foretages med materialer, som oftest findes i de fleste elektrofysiologi laboratorier, eller let købt. Dissektion er enkel og hurtig, med den mekaniske forskydning leveres af en generisk elektrokeramiske wafer styret af proprietær software. Den samme software også registrerer og analyserer electroneurogram udgang. Registreringen af det fremkaldte nerveaktivitet er gennem en kommerciel differential forstærker forbundet til brand-poleret standard glas mikroelektroder. Nyttige tips er givet for at forbedre kvaliteten af forberedelsen, stimulering og optageforholdene at optimere optagekvalitet. Systemet er velegnet til analyse af de elektrofysiologiske og optiske egenskaber af lancetformede terminaler palisade endelser hårsækkene, samtresultater af deres farmakologiske og / eller genetisk manipulation. Et eksempel på at kombinere elektrisk optagelse med mekanisk stimulering og mærkning med et styryl pyridinium vitalfarvestof er givet.
De lancetformede terminaler sensoriske axoner innerverer hårsækkene i pattedyr danner palisader omkring håret-akslen epitel. Deres formål er at afsløre mekanisk forskydning af hårene de omgiver. De er en blanding af hurtigt og langsomt tilpasse endelser, der overvejende producerer korte byger af aktivitet som reaktion på håret bevægelse. Aktivitet ophører meget hurtigt, når bevægelsen standser, selv i nærvær af en fortsat forskydning. Her beskriver vi udviklingen af denne murine pinna model for korrelative studier af struktur og funktion i lancetformede terminaler. Den ydre øre har mange fordelagtige funktioner til at studere disse endelser. Først, pinna er væsentlige to lag af huden apposed back-to-back, med lidt andre væv mellem at forstyrre adgangen til folliklerne og terminaler. Huden er meget tynd og let dissekeret grund af minimale mængder af hård bindevæv. Den innervation er let tilgængelig og kan identificeres. Mens hår follicles er til stede, er de relativt tyndt fordelt, lette stimulering af individuelle eller små grupper af hårsække mekanisk. Den tynde underliggende hudlag giver god tilgængelighed til de nerveender med farmakologiske stoffer og farvestoffer. Dette gør dem særligt egnet til den billeddannende undersøgelser under anvendelse af fluorescensmikroskopi. Billedtromlen kan enten være i levende terminaler, eller efter fiksering og yderligere histologisk bearbejdning.
Svarene fra mechanosensory neuroner innerverer hårsækkene er traditionelt blevet undersøgt i gnaver vibrissae 1,2 og, i mindre grad, i isolerede hud præparater 3,4. Disse har lært os meget om de generelle principper for mechanosensory fysiologi i nerveender omkring hårstrået. Den vibrissal forberedelse giver udsøgt kontrol over bevægelsen af en enkelt hårsæk. Imidlertid kan det være vanskeligt at dechifrere output på grund af sin kompleksitet, som vibrissalhårsække indeholder mindst 8 forskellige typer anatomisk distinkt mechanosensory slutning 5 og matchning af disse morfologiske typer til specifikke elektrofysiologiske svar er stadig genstand for tvist. Musen hud / vena nerve præparat er oftest bruges i sin afhåret tilstand at undersøge røre og smerte svar. Den innervation af hårsækkene i et sådant præparat er mindre kompleks, men tætheden af hårsækkene, plus tilstedeværelsen af tre forskellige follicle typer (vagt, Syl / auchene og zigzag hår) i en sådan nærhed 6, betyder at studere de konkrete svar på en enkelt follikel eller enkelt type slutning igen udfordrende. Desuden dette præparat indebærer en kompleks dissektion. Endelig i både vibrissal og andre hudpræparater, er det vanskeligt at visualisere endelser involveret mens ex vivo præparater er stadig i live. Således er vævssektionering kræves selv i GFP-udtrykkende muse linjer. Alternatiholdsvis, den ønsker yderligere histologisk / immunologisk bearbejdning, såsom fiksering og / eller antistof inkubering i immunfluorescens.
Derfor har vi udviklet pinna forberedelse og brugte det til at lave elektriske optagelser fra et begrænset population af hårsækken afferente og viser, at membranen cykling forekommer i disse lancetformede slutninger, fremgår af optagelse af styryl pyridinium farvestoffer. Endelig viste vi, at farvestoffet ikke interfererer med mekanisk følsomhed, hvilket indikerer, at det ikke blokerer mechanotransduction kanaler. Resultaterne af simple stimulering og analyse protokoller er illustreret.
Her, har vi udviklet et relativt simple metoder, der hurtigt kan dissekeres, har lav hårsækken tæthed og tillader relativt selektiv mekanisk stimulering af et lille antal hårsække. Det er let tilgængelige for elektrofysiologisk optagelse og live-cell fluorescerende billeddannelse, herunder svarene at farve program til at visualisere mekanisk stimuleret hårsækkene, dvs. imaging hårsække med definerede elektrofysiologiske svar. Mens vi ikke har gjort det, dette system synes også let modtagelige for sub-dividere sensoriske nerve til én enhed (enkelt sensorisk Axon) optagelse og brug af målrettet GFP-udtryk til visualisering sensoriske terminal slutter morfologi.
Vi har anvendt præparat ørehuden at undersøge egenskaberne ved internalisering og frigivelse af de fluorescerende membran styryl pridinium farvestoffer 7, en teknik oprindeligt udviklet til at studere lokaliseret vesicle membran genbrug i synaptiske terminaler 8. I synapser, er imaging også let kombineres med samtidig elektrofysiologiske optagelse af svarene på identificerede terminaler 8,9. Det var i disse tidlige undersøgelser, vi først bemærkede de farvestoffer blev også internaliseret af mechanosensory endelser 10. For sensoriske neuroner i kultur og i cochlea hårceller, meget af mærkningen ved styryl pyridinium farvestoffer synes at involvere farvestoffer passerer gennem mechanosensory kanaler, som de derefter blokerer 11,12. Farvestofferne derefter mærke intracellulære membraner, og dette mærkning er irreversibel. Men i hårceller, der ikke er mekanisk stimuleret 13,14 og i fuldt differentierede primære sensoriske nerveender i situ, såsom Ia slutninger i muskel spindler 15 og i de lancetformede slutninger her 7, mærkning styrylfarvestof synes at afspejle membran endocytose, da mærkning er reversibel og ikke blokere mechanosensory responses 7,15,16. Mens nogle farvestof internalisering af kanal gennemsivning i disse endelser ikke kan udelukkes helt ud, er det klart af den fortsatte affyring under farvestof inkubation og reversibilitet mærkningen, at det store flertal af mærkningen i differentierede terminaler i stedet er ved internalisering med genbrug vesikel membran. Således er denne simple teknik let anvendes til kombineret elektrisk og optisk overvågning af en række mechanosensory terminalfunktioner i ex vivo væv.
Som med de fleste praktiske teknikker, vil reproducerbarhed kræve gentagelser og praksis. vil nu blive beskrevet nogle af de centrale punkter værd særlig opmærksomhed. Hele dissektion og indspilningen, maksimere vævslevedygtighed og overlevelse ved at sikre fremstillingen konstant perfunderet med saltvand helt mættet med 95% O2 / 5% CO2. Sørg håret hårsække er ikke fortrængt under denne proces, which vil stimulere sensorisk slutning fyring. Enten bruge en kontinuerlig, laminar flow perfusion system eller forsigtigt boble gas gennem organbadet med fine rør i en afstand fra præparatet, eller forsigtigt opdatere løsninger hver 20-30 min, holde præparatet under saltopløsning overflade på alle tidspunkter. Suge registreringselektroder fremstilles ved at modificere skarpe elektrode borsilicat pipetter normalt anvendes til intracellulær optagelse. Først forsigtigt afbryde de skarpe tips med # 3 pincet til at give en passende indvendig diameter til at passe nerverne og brand-polish med meget kort (<1 sek) udsættelse for bunsenbrænder flamme (se 2.4 og 2.5). At få et godt signal-støj-forhold under optagelse, er det vigtigt, at den elektriske impedans (modstand) i disse to elektroder begge er maksimeret og lige. Gør dette ved at være opmærksom på følgende i de to elektroder. Til optagelsen elektrode, sikre den indvendige diameter er en stram pasning for nerve, og den maksimale længde af neRVE trækkes ind i optagelsen elektrode. Forsøger at bruge bindevævet omkring nerven til effektivt forsegle elektrodespidsen. Alternativt eller derudover, trækker den smalle ende af et passende dimensioneret, tilspidsede stykke fedtvæv i siden af nerve. Derefter sætte elektroden spids ved at anvende en stærk sugning for ~ 1 min med en 50 ml sprøjte knyttet til slangen. For en godt forseglet spids, anvender stærk sugning vil simpelthen styrke effektiviteten af stikket og vil ikke trække i mere flydende eller nerve. For at undgå nerveskader, dog sikre, at bindevævet er afbøde nerven fra kompression på det omgivende materiale og EAM brusk. Den indifferente elektrode skal efterligne modstand / impedans af optagelsen elektroden så tæt som muligt. Dette er hjulpet af omhyggeligt brand-polering spidsen til så lille en blænde som muligt, uden faktisk at forsegle den. Hvis der er behov for yderligere modstand, og sæt enden af indifferente elektrode med adipoSE bindevæv, som beskrevet ovenfor for optagelsen elektrode.
Den elektrokeramiske giver udsøgt kontrol over mekanisk forskydning, både rumligt og tidsligt. Men passe gør elektriske forbindelser – høje temperaturer ødelægge dem, så du skal ikke bruge varmt loddetin. Brug metal-loaded epoxy lim, eller brug en specialist push-fit socket anbefalet af leverandøren. Dette vil både holde den fast og etablere elektrisk forbindelse. Fastgør glas stimulerende proben til elektrokeramiske med standard epoxyharpiks. Fire-polsk enden af en standard 10 cm x 1,5 mm borsilikat diameter glas kapillar rør anvendes til fremstilling plaster eller skarpe elektroder til elektrofysiologiske optagelse for at minimere risikoen for vævsskader. Hvis enkelt hårsæk stimulation er nødvendig, for at brand-polere spidsen passe en enkelt hår, og placere sonden med en enkelt hår i det åbne blænde. Dette giver udsøgt kontrol over et enkelt hår. For styryl dye mærkning, er det generelt mere ensartet i væv fra yngre dyr. Det er ikke helt klart, hvorfor, men dette afspejler sandsynligvis mindre mekanisk traume og mere effektiv fjernelse dybe væv fra de yngre væv. Vær grundig i at fjerne skummende lag der ligner den ekspanderet polystyren overliggende hårsækken baser. Men undgå at blive for kraftig, da det risikerer at fjerne nerve plexus lag og tilhørende lancetformede terminaler. Hvis der er ringe eller ingen elektrisk respons på hårsækken bevægelse, og styrylfarvestof ansøgning fører til fremherskende mærkning af talgkirtler (gul / hvid), med tydelig autofluorescens af bunden af hårskaftet snarere end lancetformede endelser (orange / gul), over-entusiastisk clearance har skadet de underliggende væv. Endelig giver et farvestof-chelateringsmiddel før billeddannelse forbedrer billedkontrasten og kvaliteten af de endelige billeder.
Denne teknik kan være nyttig i en række yderligere undersøgelser. disse could indbefatter for eksempel screening for mechanosensory kanal (er) er ansvarlig for stræk-fremkaldte responser, ved at inkubere præparatet med farmakologiske ligander der er selektive for kandidat- kanaler eller screening muselinjer med sådanne kanaler genetisk slettet. Sidstnævnte kunne kombineres med fluorescens vurdering af eventuelle ændringer i terminal morfologi på grund af genmanipulation i muse linjer, fx med Npy2r-linked GFP udtryk 17. Et sidste eksempel kan være at undersøge betydningen af synaptiske-lignende vesikler (Slvs) 7 i disse lancetformede terminaler ved at undersøge virkningen af modulatorer af SLV omsætning (Ca, Mg, latrotoxin, glutamat receptor ligander) i elastiske fremkaldte reaktioner og styrylfarvestofoptagelse /frigøre. Således er denne nye teknik åbner op for en række potentielt interessante muligheder for forskning i mechansensory neurovidenskab.
The authors have nothing to disclose.
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |