Простой биопроб для оценки факторов роста эндотелия сосудов
Summary
Мы опишем простой клеток на основе биопробы для выявления, количественной оценки и мониторинга активности членов фактора роста эндотелия сосудов семейства лигандов. Анализ использует химерные рецепторы, выраженные в клеточной линии фактор-зависимой, чтобы обеспечить полуколичественного или количественную оценку связывания рецептора и перекрестного связывания с лигандом.
Abstract
Анализ рецепторных тирозинкиназ и их взаимодействующих лигандов, участвующих в сосудистой биологии часто сложным из-за нерегулируемой экспрессии семейств родственных рецепторов, широкого спектра родственных лигандов и трудность работы с первичной культуры специализированных эндотелиальных клеток. Здесь мы опишем биопробы для выявления лигандов сосудистого эндотелиального фактора роста рецептора-2 (VEGFR-2), ключевой преобразователь сигналов, которые способствуют ангиогенез и лимфангиогенез. КДНК, кодирующую слитый внеклеточной (лиганд-связывающий) области VEGFR-2 с трансмембранного и цитоплазматического областей рецептора эритропоэтина (Epor) выражается в фактор-зависимой клеточной линии Ba / F3. Эта клеточная линия растет в присутствии интерлейкина-3 (IL-3) и вывода этого фактора приводит к гибели клеток в течение 24 часов. Экспрессии слитого рецептора VEGFR-2 / Epor обеспечивает альтернативный механизм для содействия выживанию и PotentiaLLY пролиферацию стабильно трансфецированных Ba / F3 клеток в присутствии лиганда , способного связываться и сшивающий внеклеточную часть гибридного белка (то есть, тот , который может прошивают внеклеточной области VEGFR-2). Анализ может быть выполнен двумя способами: полуколичественный подход, в котором небольшие объемы лиганда и клеток позволить быстрый результат в 24 ч и количественного подхода с участием суррогатных маркеров количество жизнеспособных клеток. Анализ относительно легко выполнить, весьма реагирует на известные VEGFR-2 лигандов и может вместить внеклеточные ингибиторы VEGFR-2 сигнализации, такие как моноклональные антитела к рецептору или лигандов, а также растворимых лигандов ловушек.
Introduction
Семейство сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), секретируемых факторов роста белков и их родственными рецепторами на поверхности клетки является важной и разнообразной группой растворимых лигандов и мембранных встраиваемый рецепторов соответственно этой функции в трансдукции сигналов через клеточные мембраны. Они действуют в основном в эндотелиальных клетках , но и в клетках эпителиального происхождения и организации системы 1,2 иммунной. Сигнальных путей, занимающихся рецепторами лиганд-активированных VEGF (VEGFRs) имеют решающее значение для основных патологий, таких как возрастная макулярная дегенерация и рака, а также терапии целятся в частых клинического использования (например, моноклональное бевацизумаб антитело, которое предназначается для VEGF-A) 3,4.
Одна из сложностей семейства VEGF является разнообразие растворимых лигандов, присутствующих в природе (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF белков, кодируемых parapox вирусом семейства ORF и змеиный яд VEGF, а также другие тормозящийизоформы VEGF-A) 2.
Эти лиганды взаимодействуют с тремя членами рецепторных тирозинкиназ семейства, а именно VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3. Эти рецепторы переменно выражены в различных типах клеток , но часто применяют совместно экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток, выстилающих кровеносные и лимфатические сосуды всех размеров 5. VEGFR-2 может связать млекопитающих лигандов VEGF-A 6, VEGF-C 7 и VEGF-D 8,9, а также вирус ORF VEGF 10 и змеиный яд VEGF 11. VEGFR-2 играет важную роль в стимулировании ангиогенеза (рост новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосудов) в эмбриональном развитии, заживление ран, рака и заболеваний глаз. В этих контекстах, лиганды , такие как VEGF-A, -C и -D связывают и активируют рецептор на кровеносных сосудов эндотелиальных клеток 12-15. На лимфатическим эндотелиальных клетках, VEGFR-2 играет роль в лимфангиогенеза, образование новых лимфатических сосудов 16. VEGF рецептором2 также может способствовать расширение и расширение основных артерий и лимфатических сосудов в здоровых тканях и болезней 17. Полное понимание VEGFR-2 – лиганд: Поэтому очень важно для развития ингибиторов для применения в лечении зависимых от ангиогенеза заболеваний 18. В то время как большинство изоформы VEGF-A связываются с VEGFR-2, протеолитическое расщепление VEGF-C и VEGF-D необходим , чтобы освободить фрагмент , состоящий из домена СЭФР-гомологии , который проявляет высокую аффинность связывания с VEGFR-2 19,20.
Мы разработали биопробы для мониторинга лигандов VEGFR-2 , который предназначен , чтобы обойти потребность в первичных эндотелиальных клеток, которые являются технически трудно прохода, дорого приобретать и культуры (требующих специальных среды) 21 и выражают несколько VEGFRs и связанных с ними скоордини- рецепторов 22. Гетеродимеризация из VEGFR-2 с другими рецепторами VEGF или корецепторами может вызвать нежелательные сложности при прицеливании на шпилькеу бинарных рецептор-лиганд взаимодействия, оценивающих деятельность , относящаяся к специфическим рецептором, или оценки влияния ингибирующих реагентов. 23. Биологический анализ сохраняет подвижность соответствующего рецептора в клеточной мембране и позволяет оценить способность лигандом связывать и сшивку внеклеточной области VEGFR-2.
Биологический анализ опирается на создание химерных рецептора, в котором внеклеточной области рецептора VEGF (в данном случае VEGFR-2), слит с трансмембранным и внутриклеточным областей рецептор эритропоэтина (Epor), член семейства рецепторов цитокина 8,24. Этот слитый белок затем экспрессируется в фактор-зависимой про-В-клеточной линии Ba / F3, при котором стимуляция с лигандом, способного связываться и сшивающий внеклеточный домен рецептора вызывает активацию цитоплазматической эффекторной области, которая способна трансдукции сигнала выживания через Янус киназ (Jaks) содействовать клеткивыживания и / или пролиферации. В противоположность этому, экспрессия полноразмерного VEGFR-2 в том же типе клеток, и стимуляцию с лигандом, не способствует выживанию и пролиферации клеток, что свидетельствует о том, что проксимальные сигнальные эффекторы VEGFR-2 пути не доступны в этом типе клеток.
Мы использовали пробу в различных контекстах для изучения связывания новых VEGFR-2 лигандов 10,19,20,24-29. В сочетании с / F3 анализа VEGFR-3-Epor-Ба, мы сравнили относительную деятельность VEGF-C и факторы роста VEGF-D для связывания и сшивания VEGFR-2 и VEGFR-3 30. Анализ используют для характеристики ингибирующей активности нейтрализующие моноклональные антитела к VEGFR-2 или VEGF-D, растворимого VEGFR-2 ловушки и пептидомиметики , ориентированных на семью СЭФР 31. Этот анализ также используется, чтобы показать способность VEGFs от различных вирусных штаммов ORF связывать и сшивка VEGFR-2 перед тестированием в первичных эндотелиальных клетках <sвверх> 10,26. Данный анализ особенно полезен для быстрого скрининга мутантов VEGFs , которые могут быть быстро начисленной за активность , прежде чем они будут введены в более трудоемких анализов эндотелиальных клеток 25 или при оценке протоколов для роста очищающий факторов 27.
Анализ мы описываем легко выполнить, а полуколичественный версия позволяет быстро определений, которые иногда требуются при мониторинге производства или очистки факторов роста, антител или растворимых рецепторов доменов для других экспериментов. Легкость использования анализа делает его идеальным дополнением к дальнейшему и более полных исследований, проведенных с первичными эндотелиальных клеток, полученных из крови или лимфатических сосудов из определенных тканей или органов и систем.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ, описанный здесь, основан на использовании кювет высокой жизнеспособностью, которые зависят от факторов роста. Поэтому клетки должны быть тщательно культивируют, чтобы гарантировать, что они являются фактором-зависимыми, и сохраняют экспрессию химерного рецептора. Обеспечени?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
Referências
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
