혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정
Summary
우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.
Abstract
혈관 생물학 관련 수용체 티로신 키나제 및 작용 리간드 분석 인해 관련 수용체 관련 리간드의 다양한 전문 내피 세포의 일차 배양 취급의 어려움 가족의 구성 적 발현 종종 도전적이다. 여기서 우리는 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2), 혈관 및 림프관을 촉진 신호의 핵심 변환기에 리간드의 검출을위한 생물학적 검정을 기술한다. 횡단 및 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR)의 세포질 영역으로 VEGFR-2의 세포 외 (리간드 결합) 영역의 융합을 코드하는 cDNA를 인자 의존적 세포주 학사 / F3 표현된다. 이 세포주는 24 시간 이내에 세포 죽음 인터루킨 -3 (IL-3),이 계수 결과의 금단의 존재하에 성장한다. VEGFR-2 / EPOR 수용체 융합의 발현은 생존과 포텐을 촉진하기위한 대안 메커니즘을 제공합니다결합 및 융합 단백질 (즉, 하나의 수 크로스 – 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역)의 세포 외 부분을 가교 결합 할 수있는 리간드의 존재 하에서 안정하게 트랜 스펙 션 된 Ba / F3 세포의 증식 에서야. 리간드와 세포의 소량은 24 시간으로 신속한 결과를 허용하는 반 – 정량적 인 접근과 생존 세포 수의 대용 마커를 포함하는 정량 방법 : 분석은 두 가지 방법으로 수행 될 수있다. 분석 수행 비교적 쉽게, 알려진 VEGFR-2 리간드에 매우 응답 및 VEGFR-2는 수용체 나 리간드 및 수용성 리간드 트랩에 대한 단일 클론 항체로 신호의 세포 외 억제제를 수용 할 수 있습니다.
Introduction
분비 된 단백질 성장 인자 및 그들의 동족 세포 표면 수용체의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리는 가용성 리간드 및 막을 매립 수용체 세포막을 가로 질러 신호를 형질 도입에 각각 해당 기능에 중요하고 다양한 기이다. 이들은 내피 세포뿐만 아니라 상피 기원의 세포 및 면역계의 1,2-들에서 주로 기능한다. 자주 임상 사용을 목표로 리간드 활성화 VEGF 수용체 (VEGFRs) 연령 관련 황반 변성 및 암과 같은 주요 병리, 중요하고, 치료제에 의해 결합 신호 전달 경로입니다 (예를 들어, VEGF-A를 대상으로하는 단일 클론 항체 베바 시주 맙) 3,4.
VEGF를 가족의 복잡성 중 하나는 자연에 존재하는 수용성 리간드 (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D는 parapox 바이러스 가족 ORF와 뱀의 독 VEGF,과 기타에 의해 인코딩 VEGF 단백질의 다양성입니다 금지의VEGF-A) (2)의 이성체.
이러한 리간드 즉 수용체 티로신 키나제 군의 3 명, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 상호 작용. 이 수용체는 가변적으로 다른 세포 유형에 표현하지만 종종 모든 규모 5의 혈액과 림프 혈관을 줄 내피 세포의 표면에 공동으로 표현된다. VEGFR-2는 포유류가 VEGF-A 6, VEGF-C (7)와 VEGF-D 8,9뿐만 아니라 ORF 바이러스 VEGF (10)와 뱀의 독 VEGF (11) 리간드 바인딩 할 수 있습니다. VEGFR-2가 혈관 배아 발달의 (기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장), 상처 치료, 암, 안과 질환을 유도하는 중요한 역할을한다. 이러한 상황에서, 이러한 VEGF-A, -C와 -D 바인드로와 리간드는 혈액 혈관 내피 세포 12-15의 수용체를 활성화합니다. 림프관 내피 세포에서 VEGFR-2 림프관 형성에서 역할 새로운 림프관 (16)의 형성을 수행한다. VEGFR-2도 팽창하고 건강한 조직과 질병 (17)의 주요 동맥과 림프관의 확장을 홍보 할 수 있습니다. VEGFR-2의 완전한 이해 : 리간드 상호 작용은 혈관 신생 – 의존성 질환을 치료하는 (18)에 사용하기위한 억제제의 개발이 중요하다. VEGFR-2 VEGF-A 바인드 대부분의 동종은, VEGF-C와 VEGF-D의 단백질 분해 절단은 VEGFR-2 (19, 20)에 결합하는 높은 친 화성을 나타내는 VEGF-상동 도메인으로 구성된 단편을 해제 할 필요가있다.
우리는 21 (전문 매체를 필요로) 차 내피 통로에 기술적으로 어려운 세포, 구입 비용과 문화에 대한 필요성을 우회하도록 설계 VEGFR-2의 리간드를 모니터링하는 생물 검정을 개발하고 여러 VEGFRs을 표현하고 코를 연결 한 (22) 수용체. 스터드 목표로 할 때 다른 VEGF 수용체 또는 공동 수용체와 VEGFR-2의 Heterodimerization 불필요한 복잡성을 야기 할 수Y 이진 수용체 – 리간드 상호 작용, 특정 수용체에 기인하는 활성을 평가하거나 억제 시약의 효과를 평가. 23. 생물학적 검정법은 세포막의 관련 수용체의 이동도를 유지하고 결합 리간드의 능력 크로스 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역의 평가를 허용한다.
생물학적 검정법 (이 경우 VEGFR-2)은 VEGF 수용체의 세포 외 영역은 상기 트랜스과 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR), 사이토 카인 리셉터 패밀리의 구성원의 세포 내 영역에 융합시킨, 키메라 수용체의 생성에 의존 8,24. 이 융합 단백질은 그 후, 인자 – 의존 프로 B 세포주 학사 / F3로 표현 결합 및 수용체의 세포 외 도메인이 가능한 세포질 효과기 영역의 활성화를 일으키는 가교 결합 할 수있는 리간드되는 자극에 따라 셀을 촉진하기 위해 야누스 키나제 (JAKs)를 통해 생존 신호를 열 변환의생존 및 / 또는 증식. 반면, 리간드와 전체 길이 VEGFR-2와 동일한 세포 유형, 그리고 자극의 발현은 VEGFR-2 통로의 근위 신호 이펙터이 세포 유형에서 사용할 수없는 것을 나타내는, 세포 생존 및 증식을 촉진하지 않습니다.
우리는 새로운 VEGFR-2 리간드 10,19,20,24-29의 결합을 탐구하는 다양한 상황의 분석을 사용했다. VEGFR-3 EPOR-BA / F3 분석과 함께, 우리는 바인딩 및 VEGFR-2 및 VEGFR-3 (30)을 가교하기위한 기준으로 VEGF-C의 활동 및 VEGF-D 성장 인자를 비교 하였다. 상기 분석은 VEGFR-2, VEGF-D, 가용성 VEGFR-2 트랩 및 VEGF 패밀리 31 타겟팅 펩티 모노클로 중화 항체의 억제 활성을 특성화하는데 사용되어왔다. 분석은 기본 내피 세포에 결합하는 다른 ORF 바이러스 균주에서 VEGFs의 능력과 가교 VEGFR-2 이전 테스트에 표시하는 데 사용 <s> 10, 26입니다. 분석은 그들이 더 힘든 내피 세포 분석 25시 정화 성장을위한 평가 프로토콜 (27) 요인에 도입되기 전에 신속하게 활동 평가 될 수있다 VEGFs의 돌연변이의 빠른 검사에 특히 유용합니다.
우리가 묘사 분석을 수행하기 용이하며, 반 정량적 버전은 성장 인자, 항체 또는 다른 실험 가용성 수용체 도메인의 제조 또는 정제를 모니터링 할 때 종종 필요한 빠른 결정을 허용한다. 분석의 사용의 용이성은 특정 조직 또는 기관 시스템에서 혈액이나 림프 혈관에서 파생 된 차 내피 세포로 수행 더욱 더 완벽한 연구에 이상적인 보완한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 분석은 성장 인자에 의존 높은 생존 세포를 사용하는 방법에 의존한다. 세포는 따라서 그들이 인자 의존 확인하고 키메라 수용체의 발현을 유지하기 위해주의 깊게 배양 할 필요가있다. 매체가 갓과 지나치게 긴 기간 동안 및 WEHI-3D CM이 중요 매우 활성화되어 저장되지 않도록. 세포를 완전히 구출 리간드에 세포를 노출 할 때 잔류 IL-3 분석을 오염되지 않도록 상기 분석 배지?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
Referências
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