La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos
Summary
Una regulación de puesta a punto de la transcripción génica subyace en la decisión del destino celular embrionaria. En este documento, se describen ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina utilizados para investigar la regulación epigenética de tanto la diferenciación cardiaca de células madre y el desarrollo cardiaco de embriones de ratón.
Abstract
la transcripción del gen específico es un proceso biológico fundamental que subyace en la decisión del destino celular durante el desarrollo embrionario. El proceso biológico está mediada por factores de transcripción que se unen regiones reguladoras genómicas que incluyen potenciadores y promotores de los genes constitutivos cardíacas. ADN se envuelve alrededor de las histonas que se someten a modificaciones químicas. Las modificaciones de las histonas conducen a más reprimida, que se activa la transcripción de genes o aplomado, con lo que otro nivel de regulación de puesta a punto de la transcripción génica. Las células madre embrionarias (células ES) recapitulan dentro de cuerpos embrionarios (es decir, los agregados de células) o en cultivo 2D los primeros pasos del desarrollo cardíaco. Proporcionan, en principio, suficiente material para la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), una tecnología ampliamente utilizada para identificar las regiones reguladoras de genes. Además, las células madre embrionarias humanas representan un modelo celular humano de cardiogénesis. En etapas posteriores del desarrollo, los tejidos de embriones de ratón permiteninvestigar paisajes epigenéticos específicos necesarios para la determinación de la identidad de la célula. Aquí se describe protocolos de microprocesador, microprocesador secuencial seguida de PCR o chip-secuenciación utilizando células madre embrionarias, cuerpos embrionarios y regiones embrionarias específicas cardiacas. Estos protocolos permiten a la investigación de la regulación epigenética de la transcripción de genes cardiacos.
Introduction
El corazón es el primer órgano en formarse y llegar a ser funcional en el embrión. El corazón está construido a partir de muchos linajes de células que surgen de la primera y segunda campos corazón embrionario 1. Desde el blastocisto después de la fertilización etapa de seguimiento a la forma de corazón, las células embrionarias tienen por tanto que tomar muchas decisiones del destino celular. La transcripción de genes está regulada de una manera en tiempo y espacio-dependiente y es un proceso biológico fundamental que subyace en la decisión del destino celular durante el desarrollo embrionario. Tal proceso está mediado por factores de transcripción específicos que se unen regiones reguladoras dentro del genoma incluyendo potenciadores y promotores de los genes constitutivos cardíacas. ADN se envuelve alrededor de las histonas que están sometidas a modificaciones tales como acetilación, metilación, ubiquitinylation, y / o fosforilación. Modificación de las histonas conduce a la transcripción de genes reprimidos, activado o contrapesado dependiendo de qué residuo de lisina de la histona se modifica 2.
jove_content "> ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ha sido creada hace 3 años y es actualmente la tecnología más ampliamente utilizado con el fin de identificar los objetivos de cualquiera de las histonas modificadas o factores de transcripción 4. A raíz de la inmunoprecipitación de las histonas o factores de transcripción, DNA unido puede ser ya sea amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o se secuencian. chIP ha superado técnicamente más desafiantes ensayos de retardo en gel 5. sin embargo chIP no implica la unión directa de un factor de transcripción al ADN, una ventaja de ensayo de retardo en gel. por otra parte, el chip combinado para la secuenciación del ADN ha abierto una nueva perspectiva de todo el genoma en la regulación de genes.Células madre embrionarias (células ES) recapitulan dentro de cuerpos embrionarios (es decir., Agregados de células) o en cultivo 2D los primeros pasos del desarrollo cardiaco 6 y proporcionan, en principio, suficiente material para el chip. Además, las células madre embrionarias humanas representan un modelo celular humano de la cardiogenesis a pesar de su potencial cardiogénico depende de su firma epigenética 7. En etapas posteriores del desarrollo, los tejidos de embriones de ratón permiten para la investigación de paisajes epigenéticos específicos necesarios para la determinación de la identidad de la célula. Sin embargo, el genoma se transcribe de forma 8-tipo específico tiempo y celular. La regulación epigenética de la transcripción génica tiene que ser estudiado dentro de las regiones localizadas. Aquí se describe protocolos de microprocesador, microprocesador secuencial seguida de PCR o secuenciación utilizando células madre embrionarias, cuerpos embrionarios y regiones embrionarias específicas cardiacas. Estos protocolos permiten a la investigación de la regulación epigenética de la transcripción de genes cardiacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La epigenética se ha convertido en un importante campo de investigación en biología del desarrollo. ¿Cómo un programa genético se activa en las células embrionarias para permitir que las células de la adquisición de una identidad específica dentro de un linaje embrionario ha sido durante mucho tiempo una cuestión clave para los biólogos del desarrollo.
ChIP se ha usado ampliamente en los últimos años y combinado para la secuenciación del ADN después de la mejora en la resoluc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
Referências
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