अगर सही जीन मुंह बंद: संभावित कैंसर चिकित्सीय एजेंटों के लिए एक Heptamer-प्रकार के छोटे गाइड आरएनए लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग
Summary
यहाँ हम रक्त कैंसर के खिलाफ संभावित चिकित्सीय दवाओं के लिए एक heptamer प्रकार sgRNA पुस्तकालय की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Abstract
अगर सही जीन मुंह बंद करने के बाद (टीआर Nase जेड एल करार दिया – यू tilizing ई fficacious जीन मुंह बंद) आरएनए का निर्देशन जीन प्रौद्योगिकियों मुंह बंद है, जो एक कृत्रिम छोटे गाइड आरएनए (sgRNA) का इस्तेमाल tRNA 3 'प्रसंस्करण endoribonuclease, tRNase जेड एल मार्गदर्शन में से एक है , एक लक्ष्य शाही सेना पहचान करने के लिए। sgRNAs किसी भी अभिकर्मक अभिकर्मकों बिना कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है और अपने लक्ष्य आरएनए स्तरों downregulate और / या मानव कैंसर कोशिकाओं में apoptosis प्रेरित कर सकते हैं। हम मानव मायलोमा और ल्यूकेमिया कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर प्रभाव के लिए 156 heptamer प्रकार sgRNAs युक्त एक sgRNA पुस्तकालय की जांच की, और पाया कि उनमें से 20 कुशलता से कैंसर कोशिका लाइनों के कम से कम एक में apoptosis प्रेरित कर सकते है। यहाँ हम रक्त कैंसर के खिलाफ संभावित चिकित्सीय दवाओं के लिए एक heptamer प्रकार sgRNA पुस्तकालय की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल कैसे sgRNA पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए, कैसे सेल व्यवहार्यता, और प्रत्येक पर sgRNA के प्रभाव का आकलन कैसे फू करने के लिए शामिलrther प्रवाह cytometry द्वारा प्रभावी sgRNAs का मूल्यांकन। 2,000 के आसपास हिट पूर्ण पैमाने पर sgRNA 16,384 heptamers से बना पुस्तकालय स्क्रीनिंग द्वारा प्राप्त किया जा करने की उम्मीद होगी।
Introduction
अगर सही जीन मुंह बंद करने के बाद (टीआर Nase जेड एल करार दिया – यू tilizing ई fficacious जीन मुंह बंद) आरएनए का निर्देशन जीन मुंह बंद प्रौद्योगिकियों 1 में से एक है। इस तकनीक विकसित की tRNase जेड एल (या 3 'tRNase), tRNA 3' प्रसंस्करण endoribonuclease के गुणों के आधार पर किया गया है: यह एक पहचानने से एक कृत्रिम छोटे गाइड आरएनए (sgRNA) की दिशा के तहत किसी भी उम्मीद साइट पर किसी भी लक्ष्य शाही सेना काटना कर सकते हैं 9 – लक्ष्य शाही सेना और sgRNA 2 के बीच का गठन पूर्व tRNA की तरह या सूक्ष्म पूर्व tRNA की तरह संरचना। sgRNA, जो आमतौर पर 7-31 NT लंबाई में है, चार समूहों, 5'-आधा tRNA, heptamer आरएनए, 14-NT रेखीय शाही सेना, और हुक आरएनए में वर्गीकृत किया जाता है।
15 – हम कोशिकाओं 10 में रहने वाले विभिन्न कृत्रिम रूप से डिजाइन sgRNAs शुरू से सच जीन मुंह बंद करने की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है। हम यह भी पता चला है कि sgRNAs कोशिकाओं वाई द्वारा लिया जा सकता हैकिसी भी अभिकर्मक अभिकर्मकों thout और उनके लक्ष्य शाही सेना के स्तर को downregulate और / या मानव कैंसर की कोशिकाओं को 16 में apoptosis प्रेरित कर सकते हैं – 18। 21 – सही जीन मुंह बंद intracellular और tRNase जेड एल और प्राकृतिक sgRNAs 19 के माध्यम से कहनेवाला जीन विनियामक नेटवर्क सिस्टम पर काम करने के लिए प्रकट होता है।
हम रक्त कैंसर के लिए 22 संभावित चिकित्सीय heptamer प्रकार sgRNAs के लिए खोज करने के लिए 156 heptamer प्रकार sgRNAs युक्त एक sgRNA पुस्तकालय का निर्माण किया है। हम मानव मायलोमा और ल्यूकेमिया कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर प्रभाव के लिए यह जांच की, और पाया कि उनमें से 20 कुशलता से कैंसर कोशिका लाइनों के कम से कम एक में apoptosis प्रेरित कर सकते है। और उनमें से 4 माउस जेनोग्राफ्ट प्रयोगों में ट्यूमर के विकास दरों को कम करने के लिए दिखाया गया है।
यहाँ हम रक्त कैंसर के खिलाफ संभावित चिकित्सीय दवाओं के लिए एक heptamer प्रकार sgRNA पुस्तकालय की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल कैसे शामिलsgRNA पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए, कैसे सेल व्यवहार्यता, और कैसे आगे प्रवाह cytometry द्वारा प्रभावी sgRNAs का मूल्यांकन करने पर प्रत्येक sgRNA के प्रभाव का आकलन करने के लिए। हालांकि इन इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं माउस जेनोग्राफ्ट मॉडल में sgRNA के सेलुलर लक्ष्य RNAs के लिए विश्लेषण और प्रभावी sgRNAs के मूल्यांकन, पारंपरिक तरीकों 17,22 के अनुसार किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लक्ष्य पर ही आधारित अनुसंधान एवं विकास, जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी, जापान के निजी स्कूलों के लिए संवर्धन और आपसी सहायता निगम से साइंस रिसर्च प्रमोशन कोष के माध्यम से अनुकूलनीय और निर्बाध प्रौद्योगिकी हस्तांतरण कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया था, और JSPS KAKENHI अनुदान नंबर 24300342 और 15H04313 ।
Materials
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
Referências
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