TRUE genet Slå: Screening av en Heptamer-type liten guide RNA bibliotek for potensielle kreft Terapeutiske midler

Summary

Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft.

Abstract

TRUE genet Slå (kalt etter tR nase Z ^L – u tilizing e fficacious genet Slå) er en av RNA-rettet genet stanse teknologier, som benytter en kunstig liten guide RNA (sgRNA) til å veilede tRNA 3 'behandling endoribonuclease, tRNase Z ^L , for å gjenkjenne et target RNA. sgRNAs kan tas opp av cellene uten transfeksjon reagenser, og kan nedregulere sitt target-RNA-nivå og / eller induserer apoptose i humane kreftceller. Vi har vist en sgRNA bibliotek inneholdende 156 heptamer-type sgRNAs for virkning på levedyktigheten til human myelom og leukemi celler, og fant at 20 av dem kan effektivt indusere apoptose i minst en av de kreftcellelinjer. Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft. Protokollen inkluderer hvordan å konstruere sgRNA biblioteket, hvordan å vurdere effekten av hver sgRNA på celle levedyktighet, og hvordan du kan further evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Rundt 2000 treff forventes å oppnås ved screening fullskala sgRNA bibliotek består av 16,384 heptamers.

Introduction

TRUE genet Slå (kalt etter tR nase Z ^L – u tilizing e fficacious genet Slå) er en av de RNA-rettet genet Slå teknologier ^1. Denne teknologien har blitt utviklet basert på egenskapene til tRNase Z ^L (eller 3 'tRNase), tRNA 3' behandling endoribonuclease: det kan holde seg noen mål RNA når som forventet stedet i regi av en kunstig liten guide RNA (sgRNA) ved å anerkjenne en pre-tRNA-lignende eller mikro-pre-tRNA-lignende struktur dannet mellom target RNA og sgRNA ^{2 – 9.} sgRNA, som vanligvis er 7-31 nt i lengde, er inndelt i fire grupper, 5'-halv-tRNA, heptamer RNA, 14-nt lineær RNA og RNA-krok.

Vi har vist effekt av TRUE genet Slå ved å innføre ulike kunstig designede sgRNAs i levende celler ^10-15. Vi har også vist at sgRNAs kan tas opp av celler without noen transfeksjon reagenser og kan nedregulere sine mål RNA nivåer og / eller indusere apoptose i humane kreftceller ^{16 – 18.} TRUE genet Slå ser ut til å fungere på den intracellulære og inter gennettverk system via tRNase Z ^L og naturlige sgRNAs ^{19 – 21.}

Vi har konstruert en sgRNA bibliotek som inneholder 156 heptamer-type sgRNAs å søke etter potensielle terapeutiske heptamer-type sgRNAs for blod kreft ^22. Vi har undersøkt den for virkning på levedyktigheten til human myelom og leukemi celler, og fant at 20 av dem kan effektivt indusere apoptose i minst en av de kreftcellelinjer. Og fire av dem har vist seg å redusere svulstvekstrater i mus xenograft eksperimenter.

Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft. Protokollen inkluderer hvordanå konstruere sgRNA biblioteket, hvordan å vurdere effekten av hver sgRNA på celle levedyktighet, og hvordan man skal videre vurdere effektive sgRNAs av flowcytometri. Analyse for sgRNA cellulære mål RNA og evaluering av effektive sgRNAs i mus xenograft-modeller kan bli utført ifølge konvensjonelle fremgangsmåter ^17,22, selv om disse ikke er inkludert i denne protokollen.

Protocol

1. Bygging av en Heptamer-type sgRNA Library Velg en undergruppe av 16,384 (4 7) 7-nt sekvenser med mindre fullskala bibliotek skal bygges. MERK: Sekvensene kan være tilfeldig og / eller utformet for å målrette bestemte cellulære RNA. For den sistnevnte, finner hårnålstrukturer likner den T-arm av tRNA i en mål-RNA ved hjelp av et passende dataprogram og / eller visuelt, og ved å velge sekvenser komplementære til 7-nt-sekvenser umiddelbart nedstrøms for hårnålstrukturer 4,10…

Representative Results

De seks heptamer-type sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), og 5'-CACCAGC-3' (H13260) ble kjemisk syntetisert som 2'-O-metyl RNA inneholdende 5'- og 3'-fosfater. Disse sgRNAs ble undersøkt for virkninger på levedyktigheten til en human leukemicellelinje HL60, og en human …

Discussion

In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…

Materials

Custom heptamer RNA	Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC Cartridge	Transgenomic	99-3860
Water-for-injection-grade Water	Otsuka Pharmaceutical	7131400A2129
RPMI-1640 medium	Wako	189-02025
Fetal Bovine Serum	SIGMA-ALDRICH	172012-500ML
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	Nacalai Tesque	26253-84
96 Well Plate	Greiner Bio-one	655 180
Cell Counting Kit-8	DOJINDO	343-07623	WST-8 solution
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R	TEKAN	510-82851
FACS Round-Bottom Tube	BD Falcon	60819-820
Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer	BD Biosciences	51-66121E
PE Annexin V	BD Biosciences	51-65875X
7AAD	SIGMA-ALDRICH	A9400-1MG
Flow Cytometer, FACSCalibur	BD Biosciences	342973