TRUE geners: Screening av en heptameren-typ liten guide RNA bibliotek för potentiella cancer terapeutiska medel
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för screening av en heptamer-typ sgRNA bibliotek för potentiella terapeutiska läkemedel mot blodcancer.
Abstract
TRUE geners uttryck (benämnd efter tR Nase Zl – u tilizing e fficacious geners uttryck) är en av RNA-riktad geners uttryck teknik, som utnyttjar en artificiell liten guide-RNA (sgRNA) för att styra tRNA 3 "behandling endoribonukleas, tRNase Zl att erkänna en mål-RNA. sgRNAs kan tas upp av celler utan några transfektionsreagens och kan nedreglera deras mål-RNA-nivåer och / eller inducera apoptos i humana cancerceller. Vi har screened ett sgRNA bibliotek innehållande 156 heptamer-typ sgRNAs för effekten på viabiliteten hos humana myelom och leukemiceller, och fann att 20 av dem på ett effektivt sätt kan inducera apoptos i åtminstone en av de cancercellinjer. Här presenterar vi ett protokoll för screening av en heptamer-typ sgRNA bibliotek för potentiella terapeutiska läkemedel mot blodcancer. Protokollet omfattar hur man skall konstruera sgRNA biblioteket, hur man bedöma effekten av varje sgRNA på cellviabilitet, och hur man further utvärdera de effektiva sgRNAs genom flödescytometri. Omkring 2000 träffar förväntas erhållas genom screening av fullskalig sgRNA bibliotek bestående av 16384 heptamerer.
Introduction
TRUE geners uttryck (benämnd efter tR Nase Zl – u tilizing e fficacious geners uttryck) är en av de RNA-styrda teknik geners uttryck 1. Denna teknik har utvecklats baserat på egenskaper hos tRNase Z L (eller 3 'tRNase), tRNA 3 "behandling endoribonukleas: det kan klyva alla mål-RNA vid eventuellt förväntat plats under ledning av en konstgjord liten guide-RNA (sgRNA) genom att erkänna en pre-tRNA-liknande eller mikro-pre-tRNA-liknande struktur som bildas mellan mål-RNA och sgRNA 2-9. sgRNA, som vanligtvis är 7-31 nt i längd, kategoriseras i fyra grupper, 5'-halv-tRNA, heptamer RNA, 14-nt linjär RNA, och krok-RNA.
Vi har visat att effekten av TRUE geners uttryck genom att införa olika artificiellt utformade sgRNAs i levande celler 10-15. Vi har också visat att sgRNAs kan tas upp av celler without eventuella transfektionsreagens och kan nedreglera deras mål-RNA-nivåer och / eller inducera apoptos i humana cancerceller 16 – 18. TRUE geners uttryck verkar fungera på den intracellulära och inter genreglerande nätverkssystem via tRNase Zl och naturliga sgRNAs 19 – 21.
Vi har konstruerat en sgRNA bibliotek innehållande 156 heptamer typ sgRNAs att söka efter potentiella terapeutiska heptamer-typ sgRNAs för blodcancer 22. Vi har screenas det för effekten på viabiliteten hos humana myelom och leukemiceller, och fann att 20 av dem på ett effektivt sätt kan inducera apoptos i åtminstone en av de cancercellinjer. Och fyra av dem har visat sig minska tumörtillväxttakt i mus xenograft experiment.
Här presenterar vi ett protokoll för screening av en heptamer-typ sgRNA bibliotek för potentiella terapeutiska läkemedel mot blodcancer. Protokollet omfattar huratt konstruera sgRNA biblioteket, hur man bedöma effekten av varje sgRNA på cellviabilitet, och hur man ytterligare utvärdera effektiva sgRNAs genom flödescytometri. Analys för sgRNA cellulära mål RNA och utvärdering av effektiva sgRNAs i mus xenograft-modeller kan utföras i enlighet med konventionella metoder 17,22, även om dessa inte ingår i detta protokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Anpassningsbar och Seamless Technology Transfer Program genom målstyrt FoU, Japan Science and Technology Agency, Science Research Promotion Fund från kampanjen och Mutual Aid Corporation för Privata skolor i Japan, och JSPS KAKENHI Grant Numbers 24300342 och 15H04313 .
Materials
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
Referências
- Scherer, L., Rossi, J. J., Morris, K. V. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. , 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
