TRUE 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 RNA 라이브러리의 심사
Summary
여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
TRUE 유전자 침묵은 (TR Nase Z의 L 후 라 – 유 전자 fficacious 유전자 침묵 tilizing)의 tRNA 3 '처리 endoribonuclease, tRNase Z L을 안내하는 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)을 이용 기술을 입을 RNA의 지시 유전자 중 하나입니다 , 표적 RNA를 인식한다. sgRNAs 모든 형질 전환 시약없이 세포에 의해 용해 될 수 있고, 그들의 표적 RNA 수준을 하향 조절 및 / 또는 인간의 암세포에서 아폽토시스를 유도 할 수있다. 우리는 인간 골수종 및 백혈병 세포의 생존에 미치는 영향 156 헵 타머 형 sgRNAs 함유 sgRNA 라이브러리를 스크리닝하고 20 효율적으로 암세포의 적어도 하나의 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 발견 하였다. 여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 세포 생존, 그리고 각 sgRNA의 효과를 평가하는 방법 쿵푸를하는 방법 sgRNA 라이브러리를 구성하는 방법을 포함rther는 유동 세포 계측법에 의해 유효 sgRNAs을 평가합니다. 약 2,000 명중은 16,384 heptamers 이루어지는 본격적인 sgRNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어 질 것으로 예상된다.
Introduction
(TR Nase Z의 L 후 라 – 유 전자 fficacious 유전자 침묵을 tilizing) TRUE 유전자 침묵은 RNA 지시 유전자 침묵 기술 (1) 중 하나입니다. 이 기술은 개발 tRNase Z L (또는 3 'tRNase), tRNA의 3'처리 endoribonuclease의 속성을 기반으로하고있다 : 그것은을 인식하여 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)의 지시에 따라 어떤 예상 사이트에있는 모든 대상 RNA를 절단 할 수 있습니다 9 – 표적 RNA와 sgRNA (2) 사이에 형성된 프리 tRNA의 형상 또는 마이크로 사전의 tRNA 형 구조. 길이 NT를 일반적으로 7-31이다 sgRNA는 네 그룹, 5'- 절반의 tRNA, 헵 타머 RNA, 14 NT를 선형 RNA, 그리고 훅 RNA로 분류된다.
15 – 우리는 셀 (10) 생활에 다양한 인위적으로 설계 sgRNAs을 도입하여 TRUE 유전자 침묵의 효과를 증명하고있다. 우리는 또한 sgRNAs이 세포 위스콘신에 의해 흡수 될 수 있음을 보여 주었다모든 형질 전환 시약 사전 통 보없이 그들의 표적 RNA 수준을 하향 조절 및 / 또는 인간 암세포 (16)에 세포 자멸을 유도 할 수있다 – 18. 21 – TRUE 유전자 침묵은 tRNase Z L과 자연 sgRNAs (19)를 통해 세포 내와 세포 간 유전자 조절 네트워크 시스템에서 작동하도록 나타납니다.
우리는 혈액 암 (22)에 대한 잠재적 인 치료 헵 타머 형 sgRNAs 검색 156 헵 타머 형 sgRNAs 함유 sgRNA 라이브러리를 구축했다. 우리는 인간 골수종 및 백혈병 세포의 생존에 대한 효과를 스크리닝하고 20 효율적으로 암세포의 적어도 하나의 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 발견 하였다. 그 중 4 마우스 이종 이식 실험에서 종양 성장 속도를 감소시키는 것으로 나타났다.
여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 어떻게 포함세포 생존, 어떻게 더 유동 세포 계측법에 의해 유효 sgRNAs을 평가하는 각 sgRNA의 효과를 평가하는 방법 sgRNA 라이브러리를 구성합니다. 이러한 프로토콜이 포함되지 않더라도 마우스 이종 이식 모델에서의 셀룰러 sgRNA 표적 RNA를위한 분석 및 sgRNAs 효과의 평가는, 17, 22 종래의 방법에 따라 수행 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 대상 중심의 R & D, 일본 과학 기술 진흥기구, 일본의 사립 학교에 대한 홍보 및 공제 Corporation의 과학 연구 진흥 기금을 통해 적응력과 원활한 기술 이전 프로그램에서 지원하고, JSPS KAKENHI 그랜트 번호 24300342과 15H04313했다 .
Materials
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
Referências
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