Hier beschrijven we de gedetailleerde procedure van intestinale ischemie-reperfusie bij muizen waardoor reproduceerbaar letsel zonder sterfte aan de standaardisatie van deze techniek in het veld bevorderen. Dit model van intestinale ischemie-reperfusieschade kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.
Darmischemie is een levensbedreigende aandoening geassocieerd met een breed scala aan klinische aandoeningen waaronder atherosclerose, trombose, hypotensie, necrotiserende enterocolitis, darm transplantatie, trauma en chronische ontsteking. Intestinale ischemie-reperfusie (IR) letsel het gevolg is van acute mesenterische ischemie, veroorzaakt door onvoldoende bloedstroom door de mesenterische vaten, waardoor schade aan de ingewanden. Reperfusie na ischemie kan verder verergeren beschadiging van de darm. De mechanismen van IR letsel zijn complex en slecht begrepen. Daarom experimentele kleine diermodellen zijn cruciaal voor het begrip van de pathofysiologie van IR letsel en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
Hier beschrijven we een muismodel van acute intestinale IR verwonding die reproduceerbaar letsel van de dunne darm verschaft zonder sterfte. Dit wordt bereikt door het induceren van ischemie in het gebied van het distale ileum door tijdelijk occludinG de perifere en terminale collaterale takken van de mesenterica superior gedurende 60 min met behulp van microvasculaire clips. Reperfusie gedurende 1 uur of 2 uur na het ongeval leidt tot reproduceerbare letsel van de darm onderzocht door histologische analyse. De juiste positie van de microvasculaire clips is van cruciaal belang voor de procedure. Dus de videoclip verschaft een nauwkeurig visueel stap-voor-stap beschrijving van deze techniek. Dit model van intestinale schade IR kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.
De darm is zeer gevoelig voor onderbreking van de bloedtoevoer die ischemie en epitheliale schade veroorzaakt. Reperfusie na ischemie biedt opnieuw oxygenatie van het weefsel, en kan verder bevorderen pathologie. Daarom is intestinale ischemie en reperfusieletsel geassocieerd met een breed scala aan aandoeningen, zoals necrotiserende enterocolitis, allograft afstoting bij transplantatie dunne darm, complicaties van abdominale aorta aneurysma chirurgie, cardiopulmonale bypass, en ontstekingsdarmziekte 1,2. Intestinale IR blessure, in het bijzonder acute mesenteriale ischemie, is een levensbedreigende aandoening resulteert in morbiditeit en mortaliteit 3.
Hoewel slecht begrepen, is intestinale ischemie-reperfusie (IR) schade waarschijnlijk samenhangen met veranderingen in de darmflora en de productie van reactieve zuurstofdeeltjes en inflammatoire cytokines en chemokines 1,4-6. Dit leidt tot activatie van zowel innate en adaptieve immuunsysteem mechanismen die ontstekingen en weefselschade 1,7,8 te promoten.
Diermodellen zijn cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen van IR schade mocht eenvoudig gain en loss-of-function genetische experimenten mogelijk. Verschillende diermodellen van IR ontwikkeld die volledige vasculaire occlusie, ischemie lage stroom omvatten en gesegmenteerde vasculaire occlusie (samengevat in een recente algemene beoordeling 9). Intestinale ischemie veroorzaakt door volledige vasculaire occlusie van mesenterica superior (SMA) is een eenvoudige en veel gebruikte model van IR in grote dieren en knaagdieren 9-11. Echter, verschillende gebieden van de darm verschillende gevoeligheid voor schade. Daarnaast is de brede waaier van anesthetica, analgetica, slagader occlusie technieken, evenals inconsistentie in de duur van ischemische schade en herstel leiden tot een variabele mate van letsel verwarren ons begrip van de biologie van IR over meerdere studies. Tabel 1 toont deze inconsistenties in muizen IR studies. Het grootste nadeel van het gebruik van kortere ischemische tijd (30-45 min) richt het raam van herstel waarop waarneembare verschillen tussen patiënten en controles worden waargenomen. Milde verwonding aan het epitheel kan worden opgelost uur na reperfusie derhalve gespecialiseerd pathologische metrics nodig zijn om verschillen in epitheliale restitutie vinden. Daarentegen sterke beschadiging, zoals gezien door 100 min van ischemisch letsel kan resulteren in een totale denudement van het epitheel, mocht teruggave niet meer mogelijk, waardoor het sterftecijfer en hersteltijd. Daarom hier beschrijven we de gedetailleerde procedure van intestinale IR bij muizen, wat resulteert in reproduceerbare letsel zonder sterfte aan de standaardisatie van deze techniek in ons gebied aan te moedigen. Dit model van intestinale schade IR kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.
De ontwikkeling van muizen met IR intestinale schade sterk verbeterd begrip van de mechanismen van weefselschade en geholpen bij de ontwikkeling van mogelijke therapeutische strategieën om weefselschade 7,9,11,34 minimaliseren. De kritische stappen van dit protocol zijn de juiste positionering van de microvasculaire clips, de juiste timing van de ischemie en de juiste histologische evaluatie van IR letsel.
De duur van ischemie is essentieel voor daaropvolgende beschadiging van he…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Russische Science Foundation, verlenen geen. 14-50-00060 en LLC RUSCHEMBIO. Dit werk werd ook gesteund door de Crohn en Colitis Foundation of America verlenen 294.083 (naar AVT), en door het NIH-subsidie RO1 DK47700 (CJ).
Heated Pad | Sunbeam | E12107-819 | Alternative: Braintree Scientific heated pad |
Table top research anesthesia Machine | Vasco | UCAP 0001-0000171 | Alternative: Parkland Scientific, V3000PS |
Nose Cone | Parkland Scientific | ARES500 | |
Scavenger canister and replacement cartridge | Parkland Scientific | 80000, 80120 | |
Induction Chamber | Surgivet | V711802 | |
Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | Controlled substance, contact IACUC |
Animal clipper | Oster | Oster Golden A5 078005-050-003 | |
Ophthalmic ointment | Webster | 8804604 | |
Buprenorphine | McKesson | 562766 | Controlled substance,contact IACUC |
Ketaset (Ketamine HCl) | Pfizer | NADA 45-290 | Controlled substance, contact IACUC |
Cotton tips | Puritan medical products | 806-WC | Autoclave before use |
Betadine | Purdue Products | 67618-150-17 | 10% Povidone-Iodine |
Sterile saline solution | Aspen | 46066-807-60 | Adjust to room temperature before use |
Sterile cotton gauze pad | Fisher Healthcare | 22-415-468 | |
Non-adherent pad prepack | Telfa | 1238 | |
IR rodent thermometer | BIOSEB | BIO-IRB153 | |
Micro vascular clips, 70g | Roboz Surgical | RS5424, RS5435 | Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion |
Micro vascular clips, 40g | Roboz Surgical | RS6472 | Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion |
Clip applying forceps | World Precision Instruments | 14189 | Alternative: Roboz #RS-5410 or #RS-5440 |
Gill's 3 hematoxylin | Thermo Scientific | 14-390-17 | |
Surgical staples, Reflex 9 mm | Cell Point Scientific | 201-1000 | |
Autoclip applier | Beckton Dickinson | 427630 | |
Byopsy foam pad | Simport | M476-1 | |
Tissue cassette | Fisher Healthcare | 15182701A | Histosette II combination lid and base |
10% buffered formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
Surgical iris scissors | World Precision Instruments | 501263-G SC | Alternative: Roboz RS6816 |
Operating scissors | World Precision Instruments | 501219-G | Alternative: Roboz RS6814 |
Dressing forceps | Roboz Surgical | RS-5228, RS-8122 | Alternative: World Precision Instruments 1519-G |
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50mg | Sigma | 2106 | |
Reflex wound clip removing forceps | Roboz Surgical | RS-9263 | Alternative: World Precision Instruments: 500347 |
Mice C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock No 0664 | |
Telfa non-adherent dressings, 3×4, sterile | Coviden | 1050 |