Modelo murino de isquemia-reperfusão

Summary

Aqui nós descrevemos o procedimento detalhado de isquemia e reperfusão em ratos que resulta em lesão reprodutível sem mortalidade para incentivar a padronização da técnica em todo o campo. Este modelo de lesão por isquemia-reperfusão intestinal pode ser utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.

Abstract

isquemia intestinal é uma condição de risco de vida associada com uma ampla gama de condições clínicas, incluindo a aterosclerose, trombose, hipotensão, enterocolite necrotizante, transplante do intestino, trauma e inflamação crónica. lesão isquemia-reperfusão (IR) é uma consequência da isquemia mesentérica aguda, causada por fluxo inadequado de sangue através dos vasos mesentéricos, resultando em danos intestinal. A reperfusão após isquemia pode agravar os danos do intestino. Os mecanismos de lesão IR são complexos e pouco conhecidos. Portanto, modelos animais experimentais pequenas são críticas para a compreensão da patofisiologia da lesão de IR e o desenvolvimento de novas terapias.

Aqui nós descrevemos um modelo de rato de lesão IR intestinal aguda que fornece lesão reprodutível do intestino delgado sem mortalidade. Isto é conseguido através da indução de isquemia na região do íleo distai por temporalmente ocludinag ramos colaterais periféricos e terminais da artéria mesentérica superior por 60 min usando clipes microvasculares. A reperfusão durante 1 hora, ou 2 horas após a lesão em resultados lesão reprodutível do intestino examinado por análise histológica. posição apropriada dos clipes microvasculares é crítica para o processo. Por isso, o clipe de vídeo fornece uma descrição detalhada visuais passo-a-passo desta técnica. Este modelo de lesão intestinal de IR podem ser utilizados para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.

Introduction

O intestino é muito sensível à interrupção do fluxo sanguíneo que provoca isquemia e epitelial danos. A reperfusão após isquemia fornece a re-oxigenação do tecido, e pode promover ainda mais a patologia. Portanto, a lesão por isquemia e reperfusão intestinal está associada com uma vasta gama de patologias, incluindo enterocolite necrotizante, a rejeição de aloenxertos em transplantes do intestino delgado, complicações de cirurgia abdominal aórtica do aneurisma, bypass cardiopulmonar, e ^1,2 inflamatória doença do intestino. Lesão intestinal IR, isquemia mesentérica especialmente grave, é uma doença potencialmente fatal, resultando em morbidade e mortalidade ^3.

Embora pouco compreendida, isquemia-reperfusão (IR) lesão é pensada para ser associada com mudanças na flora intestinal, bem como a produção de espécies de oxigénio reactivas e citocinas inflamatórias e quimiocinas ^1,4-6. Isto leva a activação de ambos emNate e mecanismos imunes adaptativas que promovem a inflamação e lesão tecidual ^1,7,8.

Os modelos animais são fundamentais para a compreensão dos mecanismos de lesão IR, uma vez que permitem fácil gain- e perda de função experimentos genéticos. Vários modelos animais de IR foram desenvolvidos que incluem a oclusão vascular completa, isquemia baixo fluxo, e segmentado oclusão vascular (resumidos num recente revisão abrangente ^9). A isquemia intestinal provocada por uma oclusão vascular completa da artéria mesentérica superior (SMA) é um modelo simples e utilizada de IR em grandes animais roedores e ^9-11. No entanto, diferentes áreas do intestino ter susceptibilidade diferente a uma lesão. Além disso, a diversidade de anestésicos, analgésicos, as técnicas de oclusão da artéria, bem como inconsistência na duração das lesões de isquemia e recuperação resultado em graus variáveis ​​de lesão confundir o nosso entendimento da biologia do IR através de vários Studies. A Tabela 1 mostra estas inconsistências nos estudos IR murino. A maior desvantagem de usar o tempo de isquemia mais curtos (30-45 min) tem como alvo a janela de recuperação sobre a qual podem ser observadas diferenças discerníveis entre casos e controles. lesão leve para o epitélio pode ser resolvido de uma hora após a reperfusão, portanto especializada métricas patológicos pode ser necessário para encontrar diferenças de restituição epitelial. Em contraste, danos excessivos, como visto por 100 min de lesão isquémica pode resultar na denudement completa do epitélio, em que a restituição não é mais possível, aumentando a taxa de mortalidade, e o tempo de recuperação. Portanto, aqui nós descrevemos o procedimento detalhado de IR intestinal em camundongos que resulta em lesão reprodutível sem mortalidade para incentivar a padronização da técnica em todo o nosso campo. Este modelo de lesão intestinal de IR podem ser utilizados para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.

Protocol

Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Instituto Nacional de Saúde e orientações foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Trudeau Institute. 8-12 semanas de idade C57BL / 6 murganhos foram utilizados para o estudo. 1. Preparação para a cirurgia Preparar e esterilizar instrumentos cirúrgicos. Prepare sistema de anestesia com base em isoflurano com cone do nariz, e uma almofada aquecida. Certifique-se de almofada aquecida n?…

Representative Results

Nós optimizada do protocolo experimental de cirurgia de IV para se obter lesão induzida IR reprodutível do íleo em ratos. Os resultados representativos são demonstradas nesta secção. A Figura 1 mostra exemplos de posição clips microvasculares para induzir isquemia do íleo. setas pretas mostram a posição dos principais clipes de oclusão primeiros ramos da ordem de artéria mesentérica superior. se…

Discussion

O desenvolvimento de modelos de rato de lesão IR intestinal têm melhorado muito a compreensão dos mecanismos de lesão tecidual e ajudado no desenvolvimento de potenciais estratégias terapêuticas para minimizar danos nos tecidos ^7,9,11,34. Os passos críticos deste protocolo é o posicionamento adequado dos clipes microvasculares, timing correto da isquemia e histológica adequada avaliação da lesão IR.

A duração da isquemia é crítico para a subsequente lesão do epit?…

Materials

Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
Sterile cotton gauze pad	Fisher Healthcare	22-415-468
Non-adherent pad prepack	Telfa	1238
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3×4, sterile	Coviden	1050