Identifisering av kritiske forhold for Farging i Pea Aphid Embryoet: Økende Tissue Permeabilitet og Avtagende bakgrunnsfarging

Summary

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Abstract

Ert aphid Acyrthosiphon Pisum, med en sekvensert genom og rikelig fenotypisk plastisitet, har blitt en ny modell for genomisk og utviklingsstudier. Som andre bladlus, A. Pisum forplante seg raskt via parthenogenetic viviparous reproduksjon, hvor embryoene utvikle innenfor egg kamre i en samlebånds mote i ovariole. Tidligere har vi etablert en robust plattform for hel-mount in situ hybridisering tillater påvisning av mRNA uttrykk i bladlus embryoer. For å analysere uttrykket av protein, men etablerte protokoller for farging de ovarioles av aseksuelle vivipare bladlus ga ikke tilfredsstillende resultater. Her kan vi rapportere forhold som er optimalisert for å øke vev permeabilitet og redusere bakgrunnsfarging, som begge var problemer ved søknad etablerte tilnærminger. Optimaliser omfatter: (1) inkubering av proteinase K (1 ug / ml, 10 min), noe som ble funnet vesentlig feller antistoff penetrasjon i midten og sent stadium bladlus embryoer; (2) erstatning av normalt geiteserum / bovint serumalbumin med en blokkerende reagens leveres av en Digoxigenin (DIG) -basert buffer satt, og (3) anvendelse av metanol i stedet for hydrogenperoksid (H ₂ O ₂₎ for bleking av endogen peroksidase; som i betydelig grad reduserte bakgrunnsfarging i bladlus vev. Disse kritiske forhold optimalisert for immunofarging vil tillate effektiv påvisning av genprodukter i embryoene av A. Pisum og andre bladlus.

Introduction

Bladlus er hemipteran insekter med små (1-10 mm) myke kropper. De lever på planter ved å suge phloem sap med piercing munndeler. I tillegg er de avhengige en obligat endosymbiotic bakterien, Buchnera aphidicola, å syntetisere essensielle aminosyrer som er mangelfull i phloem sap kosthold. Bladlus har en kompleks livshistorie som inkluderer parthenogenetic viviparous reproduksjon i løpet av våren og sommeren lang dag fotoperioder og seksuell oviparous reproduksjon utløst av kort-dagers fotoperioder der de lå et begrenset antall overvintrende egg ^1,2. Våren disse eggene klekkes til å produsere den første generasjonen av alle kvinnelige bladlus (fundatrices), etter mange runder med parthenogenetic reproduksjon til høsten. Konjunktur parthenogenesis i bladlus, hvor aseksuelle og seksuelle faser veksler i den årlige livssyklus, har vært ansett som en evolusjonær nyhet ^1,2. I parthenogenetic vivipare bladlusTar embryogenese sted innenfor egg kamrene i eggstokkene tubuli (ovarioles). I motsetning seksuelle eggleggende embryoer utvikler seg i de befruktede eggene. Bortsett fra reproduktiv plastisitet, kan bladlus vise transgenerational vinge polyphenism: reaksjon på overfylte signaler og rovdyr trusler, kan unwinged aseksuelle kvinner viviparously produsere bevingede avkom for langdistanse migrasjon. Offentliggjøring av genomsekvens av ertebladlus Acyrthosiphon Pisum -den første genomsekvens for en basal hemimetabolous insekt tillater videre utforskning av reproduktiv plastisitet, vinge polyphenism, og andre funksjoner, inkludert insekt-plante-interaksjoner, viral vectoring og symbiose i bladlus på et molekylært basis ^tre.

I tillegg til det sekvenserte genomet, verktøy for karakterisering av gen-ekspresjon og funksjon som er nødvendig for å fremme ert bladlus som et modent modellorganisme ^4. Vi har beskrevet robuste protokoller av hel-mount <em> in situ hybridisering for å påvise ekspresjon av mRNA i bladlus embryoer ^5-7. RNA-interferens (RNAi) via dobbeltrådet RNA injeksjon og fôring har blitt brukt for genet Slå i bladlus nymfer og voksne, men stabile forhold for genet knockdown i embryoene har ennå ikke blitt rapportert ^8-10. Farging, et antistoffbasert tilnærming som kan påvise proteinekspresjon i prøvene før og etter RNAi knockdown, har blitt utført på ert bladlus embryoer ^11-13. Men økningen av vev permeabilitet og eliminering av bakgrunnsfarging er foreløpig ikke tilfredsstillende ved bruk av standardprotokoller for farging i de aseksuelle vivipare embryoer av erte bladlus. For eksempel fant vi at penetrasjon av antistoff til vev redusert i gastrulating embryoer (iscenesetter 8-10), og at embryoer med morfologisk identifiserbare lem knopper (trinn 13-14) var knapt gjennomtrengelig for antistoff. I tillegg ble bakgrunnsfarging visualiseres i aseksuell viviparooss ert bladlus embryoer farget ved hjelp av antistoff mot kimlinje markør Vasa samt at mot Engrailed / Invected protein uttrykt i embryonale segmenter ^12,13. Faktisk bakgrunnsfarging var fremdeles synlig i embryoer farget med det sekundære antistoff alene.

For å øke permeabilitet uten å ødelegge integriteten av bladlus vev, vi omhyggelig titrert konsentrasjonen av proteinase K og bestemmes optimale betingelser for vev fordøyelse på bladlus embryoer. For å unngå ikke-spesifikk farging i ertebladlus, søkte vi for forbindelser som effektivt kan blokkere embryoer og hemmer aktiviteten av endogen peroksidase (POD), et enzym som anvendes for forsterkning av signaler i løpet av immunfarging. En blokkerende reagens leveres av en Digoxigenin (DIG) -basert buffersett, heller den tradisjonelt brukt normalt geiteserum (NGS) / bovint serumalbumin (BSA), betydelig redusert bakgrunnsfarging. Videre metanol ble funnet å inhibet endogene POD-aktivitet mer effektivt enn hydrogenperoksid (H ₂ O _2). Detaljer om disse bladlusspesifikke vilkår for farging på embryo vil bli beskrevet i de neste avsnittene.

Protocol

1. Culture of Bladlus MERK:. Laboratoriet stamme av parthenogenetic viviparous ertebladlus En Pisum ble opprinnelig samlet i den sentrale Taiwan og har blitt oppdratt på vertsplanter (hagen ert Pisum sativum eller bred bønne hestebønne) etter lang dag daglengde for mer enn 300 generasjoner (én generasjon: ~ 10 dager). Spiring av frø Bløtlegg frøene av vertsplanter i vann fra springen i 3-5 dager på RT. Etterfyll med rent vann en gang per dag. …

Representative Results

I denne studien, utførte vi hel-mount immunofarging på befruktede egg av aseksuelle ert bladlus (Figur 1a). Disse hunnene produsere avkom parthenogenetically og viviparously. Disse kvinnelige fostre utvikler innen egg kamrene i eggstokkene tubuli (ovarioles) (Figur 1B og Figur 2A). Før mikroskopi, de dissekerte ovarioles er flekker mål; er imidlertid separeringen av egg kamre som kreves for observasjon av embryoer under et mikroskop …

Discussion

Vi identifiserte optimale forhold kritiske til vellykket farging i ertebladlus A. Pisum, en ny modellorganisme for genomisk og utviklingsstudier ^3,15. Optimaliserte betingelser for å øke vev permeabilitet og reduserer bakgrunnsfarging forbedret intensitet og spesifisiteten av signaler. De skiller seg fra standard protokoller for farging i andre dyremodeller i fremgangsmåten for å lage porer i cellemembraner og blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding.

For far…

Materials

30% hydrogen perxidase (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	1.1586E+10	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.