Identifiering av kritiska förhållanden för immunfärgning i Pea Aphid embryon: Öka Tissue Permeabilitet och Minska bakgrundsfärgning

Summary

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Abstract

Ärter bladlössens Acyrthosiphon pisum, med en sekvense genomet och riklig fenotypisk plasticitet, har blivit ett växande modell för iska och utvecklingsstudier. Liksom andra bladlöss, A. Pisum propagera snabbt via partenogenetiska viviparous reproduktion, där embryona utvecklas inom ägg kamrar i en församling-line mode i ovariole. Tidigare har vi etablerat en stark plattform av hela montera in situ hybridisering möjliggör detektion av mRNA uttryck i bladlöss embryon. För att analysera uttrycket av protein, men etablerade protokoll för immunfärgning av ovarioles av asexuella viviparous bladlöss inte tillfredsställande resultat. Här rapporterar vi villkor optimerade för att öka vävnads permeabilitet och minska bakgrundsfärgning, som båda var problem vid tillämpningen etablerade metoder. Optimeringar inkluderar: (1) inkubation av proteinas K (1 pg / ml, 10 min), som konstaterades väsentliga feller penetration antikropp i mitten och sena skede bladlöss embryon; (2) utbyte av normalt getserum / bovinserumalbumin med en blockeringsreagens som tillhandahålls av en Digoxigenin (DIG) -baserade buffert in och (3) Tillämpningen av metanol istället väteperoxid (H ₂ O ₂₎ för blekning av endogen peroxidas; vilket avsevärt minskade bakgrundsfärgning i bladlöss vävnader. Dessa kritiska förhållanden är optimerade för immunfärgning kommer möjliggöra en effektiv detektion av genprodukter i embryon från A. Pisum och andra bladlöss.

Introduction

Bladlöss är hemipteran insekter med små (1-10 mm) mjuka kroppar. De livnär sig på växter genom att suga phloem saven med piercing mundelar. Dessutom förlitar de sig på en obligat endosymbiotisk bakterie, Buchnera aphidicola att syntetisera essentiella aminosyror som har brist på floemet sav kost. Bladlöss har en komplex livshistoria som inkluderar partenogenetiska viviparous reproduktion under våren och sommaren lång dag fotoperioder och sexuella oviparous reproduktion utlöses av kort dagars fotoperioder under vilka de lägger ett begränsat antal övervintrande ägg ^1,2. Under våren dessa ägg kläcks att producera den första generationen av all-kvinnliga bladlöss (fundatrices), efter många rundor av partenogenetiska reproduktion fram till hösten. Den cykliska partenogenes i bladlöss, där asexuella och sexuella faser alternerar i den årliga livscykeln, har ansetts som en evolutionär nyhet ^1,2. I partenogenetiska viviparous bladlössSker embryo rum inom ägg kamrar äggstocks tubuli (ovarioles). Däremot sexuella oviparous embryon utvecklas i de befruktade äggen. Bortsett från reproduktiv plasticitet, kan bladlöss visa transgenerational vinge polyphenism: som svar på överbeläggning signaler och rovdjur hot, kan unwinged asexuella honor viviparously producerar bevingade avkomma till långväga migration. Offentliggörande av genomsekvens av ärt aphid Acyrthosiphon pisum -Den första genomsekvensen för en basal hemimetabolous insekts möjliggör ytterligare utforskning av reproduktiv plasticitet, vinge polyphenism och andra funktioner, inklusive insektsväxtinteraktioner, viral vectoring och symbios i bladlöss på molekylär grundval ^3.

Förutom det sekvense genomet, är verktyg för att karakterisera genuttryck och funktion som krävs för att främja ärta aphid som en mogen modellorganismen ^4. Vi har beskrivit robusta protokoll av hel-mount <em> in situ hybridisering för att detektera uttryck av mRNA i bladlöss embryon ^5-7. RNA-interferens (RNAi) via dubbelsträngat RNA injektion och utfodring har använts för geners uttryck i bladlöss nymfer och vuxna, men stabila villkor för gen knockdown i embryona har ännu inte redovisats ^8-10. Immunofärgning, en antikroppsbaserad metod som kan detektera proteinuttryck i prover före och efter RNAi knockdown, har utförts på ärt bladlöss embryon ^11-13. Men ökningen av vävnad permeabilitet och eliminering av bakgrundsfärgning är ännu otillfredsställande användning av standardprotokoll för immunofärgning i asexuella tång embryon av ärter aphid. Till exempel, fann vi att penetration av antikroppar till vävnaderna minskade gastrulating embryon (stegen 8-10) och att embryon med morfologiskt identifierbara lem knoppar (stegen 13-14) var knappt genomtränglig för antikropp. Dessutom har bakgrundsfärgning visualiseras i asexuell viviparous ärt bladlöss embryon färgas med användning av antikropp mot germline markör Vasa liksom den mot engrailed / Invected protein uttryckt i de embryonala segmenten ^12,13. Egentligen bakgrundsfärgning var fortfarande tydligt i embryon färgade med den sekundära antikroppen ensam.

För att öka permeabilitet utan att skada integriteten i bladlöss vävnader, titreras försiktigt vi koncentrationen av proteinas K och bestäms optimala betingelser för vävnads uppslutning på bladlöss embryon. För att undvika icke-specifik färgning i ärt bladlöss, vi sökte för föreningar som effektivt kan blockera embryon och undertrycker aktiviteten av endogen peroxidas (POD), ett enzym som används för att förstärka signaler under immunfärgning. En blockerande reagens tillhandahålls av en digoxigenin (DIG) -baserad buffertsatsen, snarare den traditionellt använda normalt getserum (NGS) / bovint serumalbumin (BSA), reducerad bakgrundsfärgning väsentligt. Dessutom tillsattes metanol befunnits inhibet den endogena POD-aktivitet mer effektivt än väteperoxid (H ₂ O _2). Närmare uppgifter om dessa bladlöss specifika villkor för immunfärgning på embryon kommer att beskrivas i de följande avsnitten.

Protocol

1. Odling av bladlöss OBS:. Laboratoriet stam av partenogenetiska tång ärt bladlöss A pisum ursprungligen samlades in i den centrala Taiwan och har fötts upp på värdväxter (trädgården ärter Pisum sativum eller bondbönor Vicia faba) under lång dag fotoperiod för mer än 300 generationer (en generation: ~ 10 dagar). Groning av frön Blöt frön av värdväxter i kranvatten i 3-5 dagar vid RT. Fyll på med färskt vatten en gång per dag. …

Representative Results

I denna studie genomförde vi hela-mount immunfärgning på embryon av asexuella ärt bladlöss (Figur 1A). Dessa honor producera avkomma parthenogenetically och viviparously. Dessa kvinnliga embryon utvecklas inom ägg kamrar äggstocks tubuli (ovarioles) (Figur 1B och figur 2A). Före mikroskopi, dissekerade ovarioles är färgnings mål; dock krävs separation av ägg kammare för observation av embryon under ett mikroskop (Fi…

Discussion

Vi identifierade optimala förhållanden avgörande för framgångsrik immunfärgning i ärt bladlöss A. Pisum, en framväxande modellorganism för iska och utvecklingsstudier ^3,15. Optimerade betingelser för att öka vävnads permeabilitet och minska bakgrundsfärgning ökat intensiteten och specificitet signaler. De skiljer sig från standardprotokoll för immunfärgning i andra djurmodeller i stegen för att skapa porer i cellmembran och blockera icke-specifik antikroppsbindning.

<p…

Materials

30% hydrogen perxidase (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	1.1586E+10	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.