In vitro Demontering af influenza A-virus capsider ved gradientcentrifugering

Summary

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Abstract

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Introduction

Influenza A-virus (IAV) er et kappebærende virus og hører til familien af Orthomyxoviridae. Dets gener er kodet på et segmenteret negativ-sense og enkeltstrenget RNA-genom. Hos mennesker IAV forårsager luftvejsinfektioner, som opstår i årstidens udbrud af epidemier og bærer risikoen for globale pandemier ^1. Efter binding til sialinsyrerester på værtscellens overflade ^2, er IAV internaliseret af clathrin-afhængig endocytose og clathrin-uafhængige veje ^3-8. Den sure miljø (pH <5,5) i de endocytiske vakuoler udløser en større konformationel ændring i IAV spike glycoprotein hemagglutinin (HA), hvilket resulterer i fusion af den virale og den sene endosomale membran ^9. Når IAV capsidet (her også omtalt som viral "kerne") er undsluppet fra sent endosomer (LES), er det uovertrukne i cytosolen efterfulgt af transport af de virale ribonucleoproteiner (vRNPs) ind i kernen – sitet of virus replikation og transkription ^10-13. Forud for syre aktivering af HA virussen oplever et gradvist fald i pH i endocytiske system, som primtal kernen for den efterfølgende demontering ^14-16. I denne "priming" step M2 ionkanaler i den virale membran mægle tilstrømningen af protoner og K ^+10,14,16. Ændringen i ionkoncentration i virusset indre forstyrrer interaktionerne opbygget af det virale matrixprotein M1 og vRNP bundtet otte, og letter IAV uncoating i cytoplasmaet efter membranfusion ^10,14-17.

Direkte og kvantitativ analyse af priming skridt er hæmmet af, at endosomer er vanskelige at få adgang til eksperimentelt. Punktet proces er i øvrigt særdeles ikke-synkron. Hertil kommer, at end-point assays, såsom QRT-PCR af frigivne virale RNA eller infektivitet målinger, ikke give et detaljeret billede om den biokemiske tilstand virale capsid på ethvert givet trin med post. Mens forstyrrelse af endosomer med siRNA eller lægemiddelbehandling har bidraget væsentligt til forståelsen af IAV post ^18-20, finjustering er vanskelig og udsat for uspecifikke bivirkninger i tæt kontrolleret endosomet modning program.

For at undgå disse problemer har vi tilpasset en tidligere udviklet in vitro protokol baseret på anvendelsen af hastigheden gradientcentrifugering ^17. I modsætning til andre forsøg ^{21,22, 23,24,} som for det meste var baseret på kombinationer af proteolytisk spaltning og rengøringsmiddel behandling efterfulgt af EM analyse, denne tilgang aktiveret en let kvantificerbare resultat. Centrifugering gennem forskellige gradient lag tillader sedimenterende partikler, der skal udsættes for og reagerer med skiftende betingelser på en kontrolleret måde. I det præsenterede protokol, IAV afledt fra klaret allantoisvæske eller oprensede viruspartikler bundfældes i en to-lags glycerolgradient, hvor det nederste lag indeholder den ikke-ionisk detergent NP-40 (figur 1). Da virus ind i andet detergent-holdige lag, er de virale lipidkappe og kappeglycoproteiner forsigtigt solubiliseret og efterladt. Kernen, der består af de otte vRNP bundt og omgivet af en matrix lag, sedimenter som en stabil struktur i pelletfraktionen. Virale kerneproteiner, såsom M1 og vRNP-associeret nukleoprotein (NP), kan identificeres i pelleten ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning. Især udnytter kommercielt tilgængelige gradientgeler og farvning med den meget følsomme kolloidt Coomassie ^25, muliggør stor præcision og detektering af selv små mængder af virale kerne-associerede proteiner.

Dette sætter grundlaget for at teste, om forskellige forhold, såsom pH, saltkoncentration, og formodede overtrækkende faktorer har virkninger på sedimentering adfærd kernekomponenter og core stabil tet. Til dette formål er kun den nederste, detergent-indeholdende lag i glycerolgradient modificeret ved indføring faktoren eller tilstand af interesse. Teknikken har været særligt værdifulde undersøge virkningen af forskellige pH-værdier og saltkoncentrationer på integriteten af IAV kerne ^16. Mellemliggende trin af IAV uncoating kunne overvåges herunder dissociering af matrixlaget ved mildt sur ​​pH (<6,5) efterfulgt af vRNP dissociation ved pH 5,5 og lavere ^16,17 (figur 1). Det sidstnævnte trin blev yderligere forstærket af tilstedeværelsen af høj K ⁺ koncentration i glycerol lag, hvilket afspejler en sen endocytiske miljø ^16. , Idet virus og kernen sedimenterede gennem gradienten oplevede de således en skiftende miljø, som efterligner tilstande i endosomer. Resultatet var en trinvis adskillelse af den virale kerne in vitro, der supplerer resultater stammer fra cellebiologiske assays.

t "> Metoden præsenteres her har muliggjort hurtig og meget reproducerbar analyse af IAV (X31 og A / WSN / 33) og IBV (B / Lee / 40) overtrækkende udløst ved sur pH og stigende K ^+16,17 samt demontering af paramyxo kerner upon alkalisk pH eksponering ^17. det er tænkeligt, at denne metode kan tilpasses andre indkapslede vira at få indblik i de biokemiske egenskaber af det virale capsid struktur og capsid demontering under celleindtrængning.

Protocol

1. Fremstilling af buffere og stamopløsninger Forbered MNT puffer (20 mM MES, 30 mM Tris og 100 mM NaCl) ved at opløse 470 mg Tris hydrochlorid, 390 mg MES hydrat og 580 mg NaCl i 80 ml ​​Hedeselskabet 2 O. Juster buffer til pH 7,4 og bringe det til et endeligt volumen på 100 ml med Hedeselskabet 2 O. Forbered tre identiske opløsninger af 500 mM MES-buffer ved opløsning 9,76 g MES-hydrat i 80 ml ​​dH2O hver. Juster buffere til pH 5,8, 5,4 og 5,0, henhold…

Representative Results

Som allerede diskuteret, priming i endosomer er forpligtet til at gøre IAV kerne uncoating kompetent. Protonering af kernen svækker interaktionen af ​​M1 og vRNPs (sammensat af det virale RNA, NP, og polymerasen komplekse PB1 / PB2 / PA). Denne proces påbegyndes, når indkommende virus udsættes for en pH-værdi på 6,5 (eller lavere) i tidlige endosomer (EBS) og fortsætter indtil fusionerer virusset ved omkring pH 5,0 i LES. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa…

Discussion

Virale capsider er metastabile makromolekylære komplekser. Mens samlingen af ​​virioner kræver indkapsling og kondensation af virusgenomet, initiering af den næste runde af infektion afhænger demontering af denne kompakte capsid struktur. Vira har udviklet sig til at udnytte forskellige cellulære mekanismer til at kontrollere belægningen-uncoating cyklus, herunder cellulære receptorer, chaperoner, proteolytiske enzymer, fysiske kræfter leveret af motordrevne proteiner eller helicaser samt pH og ioniske omski…

Materials

cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	11873580001	The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid	Merck Millipore	100063
Glycerol anhydrous BioChemica	AppliChem	A1123
Hydrochloric acid	Merck Millipore	100317
Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Methanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE® LDS sample buffer (4X)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X)	Life Technologies	NP0001
pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0	Merck Millipore	109542
QC Colloidal Coomassie Stain	BIO RAD	1610803
Sodium chloride	Merck Millipore	106406
Sodiumhydroxide	Merck Millipore	106498
Steritop™ filter unit	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris hydrochloride	AppliChem	A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid	Virapur		Freshly thawed on 4°C