A utilização de ratinhos repórter acoplado ao conjunto de montagem e a secção de coloração, microscopia e ensaios in vivo facilita a análise dos mecanismos subjacentes à padronização normal do tracto respiratório. Aqui descrevemos a forma como estas técnicas contribuiu para a análise de sinalização Wnt durante o desenvolvimento traqueal.
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Artigo de método
Estudar Wnt Signaling Durante Padronização de conduzir Airways
Neste artigo
Resumo
Resumo
Wnt As vias de sinalização desempenham papéis críticos durante o desenvolvimento do trato respiratório. A definição de mecanismos precisos de diferenciação e morfogênese controlados pela sinalização Wnt é necessária para entender como os tecidos são padronizados durante o desenvolvimento normal. Esse conhecimento também é fundamental para determinar a etiologia de defeitos congênitos, como hipoplasia pulmonar e traqueobroncomalácia. A análise dos estágios iniciais de desenvolvimento do trato respiratório impõe desafios, pois a quantidade limitada de tecido impede a realização de protocolos padrão mais adequados para estudos pós-natais. Neste artigo, discutimos metodologias para estudar a diferenciação e proliferação celular no trato respiratório. Descrevemos técnicas como coloração de montagem inteira, processamento do tecido para microscopia confocal e imunofluorescência em cortes de parafina aplicados ao desenvolvimento do pulmão traqueal. Também discutimos metodologias para o estudo da diferenciação do mesênquima traqueal, em particular a formação da cartilagem. As abordagens e técnicas discutidas no presente artigo contornam a limitação do material ao trabalhar com tecido embrionário, permitindo uma melhor compreensão do processo de padronização do desenvolvimento de vias aéreas condutoras.
Introdução
Desenvolvimento das vias respiratórias é iniciada por dia embrionário 9 (E9) com a aparência de células positivas Nkx2.1 no intestino anterior ventral endodérmica 1,2. Separação tubo esofágico-traqueal irá resolver por E11.5 quando os tubos podem ser distinguidos como entidades distintas, cada um rodeado por tecido mesenquimal 3. Sinalização Wnt desempenha um papel chave na especificação do tracto respiratório como supressão de WNT2 e Wnt2b, expressa pelo mesênquima esplânenico e eliminação de β-catenina do epitélio respiratório endodérmica irá resultar em agenesia pulmonar 4,5. Os nossos estudos anteriores ....
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Protocolo
Os animais foram alojados em condições sem agentes patogénicos. Os ratos foram tratados de acordo com os protocolos aprovados pela CCHMC Institutional Animal Care e Use Committee (Cincinnati, OH EUA). Os ratinhos utilizados ao longo destes estudos foram mantidas num fundo misto.
1. Montagem Total X-galactosidase Coloração
- Eutanásia fêmea grávida em E11.5 a E14.5, por inalação de CO 2. Coloque animais em CO 2 câmara, carregar a câmara com CO 2. Manter animais em câmara para mínimo de 5 min. Executar método secundário da eutanásia por deslocamento cervical.
- Limpo área abdominal com etano....
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Resultados
atividade / β-catenina Wnt
Whole montagem Lac-Z coloração foi detectado no tecido traqueal-pulmão de embriões isolados de repórter Axin2 Lac-Z ratos 11. Sites de coloração indicar atividade / β-catenina Wnt. Análise de secções de toda a coloração de montagem determinado que a actividade / β-catenina Wnt estava presente no mesênquima da traqueia e no mesênquima de regiões periféricas do.......
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Discussão
Eventos subjacentes a morfogénese do tracto respiratório não são completamente compreendidos, em particular os processos necessários para a modelação das vias aéreas condutoras. Estudos anteriores têm utilizado técnicas ex vivo, em que explantes em desenvolvimento são cultivadas na interfase ar-líquido ou embebido em matrigel 21,22. Estes estudos têm mostrado como factores de crescimento influenciam o padrão da traqueia desenvolvimento e a formação de cartilagem traqueal. Uma limitação para estes est.......
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Divulgações
"Os autores não têm nada para revelar."
Agradecimentos
Nós reconhecemos a assistência de Mike Muntifering e Matt Kofron com imagem confocal e Gail Macke com os procedimentos histológicos. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 para DS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , coelho |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, coelho |
| Anti Músculo Liso Actina ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, porquinho-da-índia |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n / a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, ovelhas |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, camundongo |
| PNA | Lectina Sigma | L 7381 | |
| Anticorpos secundários | Tecnologias | Alexa fluor Sondas moleculares | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Marca Fisher super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Soro de Bezerro Fetal | Sigma | 11K413 | |
| Reagente de bloqueio | Invitrogen | Componente do kit TSA #2 (T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield meio de montagem | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| de biópsia | Premiere | BC0109 | Disponível em diferentes cores |
| Vermelho nuclear rápido Kernechtrot 0,1% | Sigma | N3020 | |
| Ácido cítrico | Sigma | C1909-500G | |
| Citrato de sódio tribásico di-hidratado | Sigma | S4641-1Kg | |
| Cloridrato de Trizma | Sigma | T5941-500G | |
| Xileno | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Etanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro facas | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 revestidas de cerâmica | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Micrótomo | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Microscópio de | campo amplo | |
| NikonA1Rsi | Nikon | . Configurações: câmera NikonA1 plus, scanner: Galvano, detector: DU4. Óptica Plan Apo lambda 10X. Modalidade: Laser de fluorescência de campo amplo confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Microscópio de dissecação de fluorescência | |
| Zeiss | Zeiss | Microscópio de fluorescência automatizado | |
| Leica Suíte de aplicativos Leica | Software de imagem | Leica | |
| Software de imagem | NIS | Nikon | |
| IMARIS | Bitplane | Software de processamento de imagem |
Referências
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
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Reimpressões e permissões
