Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca2 ⁺ is een belangrijk ion in overvloed in elke cel in het lichaam. Het heeft een belangrijke rol in verschillende cellulaire functies, waaronder groei, proliferatie, migratie en apoptose ^1-4. Het staat vast dat Ca ²⁺ deze processen kunnen beïnvloeden door middel van zowel directe als indirecte acties, en daarom wijzigingen in de normale intracellulaire concentraties van deze ionen kan gemakkelijk leiden tot negatieve gevolgen voor de getroffen cellen. De SR wordt beschouwd als de grootste intracellulaire Ca2 ⁺ opslag binnen de cel ^5. Steady state niveaus van Ca ²⁺ in zowel de SR en cytoplasma worden normaal gehandhaafd door voortdurend in beweging in en uit de Ca ²⁺ transporterend kanalen van dit organel. De stressvolle omstandigheden opgelegd cellen als gevolg van enige vorm van letsel of ziekte zijn vaak geassocieerd met significante veranderingen in de SR Ca ²⁺ dat naar de langdurige effecten op het hebben hijalth van de cel. In de meest ernstige gevallen, het onvermogen van een gestresste cel om te herstellen en te onderhouden steady state SR Ca ²⁺ niveaus kunnen zelfs in de dood resulteren door apoptose ^6-8.

Lopend onderzoek naar cellulaire Ca ²⁺ dynamiek wordt beperkt door het feit dat er maar weinig studies testen organel Ca ²⁺ winkel inhoud direct ^9-11. De meest gangbare praktijk houdt in plaats meting van cytoplasmatische Ca ²⁺ levels als indirecte metingen van de veranderingen in de SR Ca ²⁺ gehalte ^12-14. In deze experimenten wordt Ca2 ⁺ gewoonlijk geïnduceerd uit de SR worden vrijgegeven door middel van farmacologische agentia die depletie van de organellen (bijvoorbeeld thapsigargine). Conclusies worden vervolgens met betrekking tot de wijzigingen in de SR Ca ²⁺ op basis van schommelingen in de cytoplasmatische Ca ²⁺ concentraties opgesteld. Ondanks de mogelijkheid resteert voor onderzoekers om dergelijke conclusies in een rotonde ma trekkennner deze wijze van SR Ca ²⁺ meting is duidelijk een indirecte manier om dergelijke informatie, met veel beperkingen met betrekking tot de interpretatie van de verzamelde gegevens verzamelt. Om deze duidelijke beperking omzeilen, is het noodzakelijk om de hoeveelheid Ca2 ⁺ direct in de SR luminale netwerk gevonden meten.

Vitaal belang voor het uiteindelijke resultaat van de mogelijkheid om intraluminale SR Ca ²⁺ niveaus rechtstreeks opnemen zijn de celkweek instrumenten en de Ca ²⁺ indicator gebruikt. Voor referentie tot de huidige manuscript data, is het belangrijk op te merken dat VSMC gebruikt kwam uit een bevroren cellijn. De cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) + 10% serum van pasgeboren kalveren (NCS) in passages 22-26 voor de beschreven experimenten, geïncubeerd bij een constante 37 ° C met 5% CO ₂ toevoer. Met de huidige werkwijze, bijvoorbeeld cellen zijn zeer succesvol gekweekt op een eiwitmengsel dat het extracellulaire simuleertmilieu van vele verschillende soorten weefsel ^15. Belangrijk voor succes langs de ader van SR Ca ²⁺ activiteit is het type eiwitmengsel gebruikt; in dit geval, een lage groeifactor verscheidenheid moest componenten van dit instrument voorkomen beïnvloedt de normale Ca2 ⁺ signalering en verplaatsingen voortdurend optreedt binnen de onderzochte cellen. Na succesvolle groei van testcellen, de Ca2 ⁺ indicator moet effectief worden ingevoerd om deze gekweekte cellen. Dit is mogelijk geworden door een adenovirale vector die de Ca2 ⁺ SR wonende indicator D1SR draagt. Om een ​​hoge transfectie efficiëntie moeten cellen worden geïncubeerd met virale vectoren voor ten minste 36-48 uur voorafgaand aan beeldvorming. Deze voorbereiding zorgt voor een betrouwbaar hulpmiddel om Ca ^{2 +} transiënten in het SR lumen met een hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te meten.

D1SR indicator gebruikt in dit protocol is een gemodificeerde variant van de D1ER Ca ²⁺ indicator die oorspronkelijk werd gemaakt door het laboratorium van Dr. Roger Y. Tsien's aan de University of California, San Diego, USA ^9,16. De originele D1ER behoort tot een tweede generatie van genetisch gecodeerde Ca2 ⁺ indicatoren genoemd kameleons dat Ca2 ⁺ gevoeligheden over een veel breder bereik (0,5-160 uM) weergegeven in vergelijking met eerdere Ca2 ⁺ indicatoren ^9,16. De nieuwe variant D1SR, een vriendelijke gift van Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Canada), echter, draagt ​​een mutant calsequestrin sequentie (in plaats van een calreticuline sequentie zoals in de oorspronkelijke D1ER). De mutant calsequestrin heeft een verminderde binding aan Ca ²⁺ dat de kwestie van te concurreren met endogene calsequestrin in binding aan Ca ²⁺ in het SR lumen ¹¹ elimineert. De D1SR indicator heeft een afgeknotte verbeterde cyaan fluorescerend eiwit (CFP) en geel fluorescerend eiwit (YFP) die binden door een linker die gemodificeerde eiwit calmoduline (CaM) en M13 (thij 26-residu peptide van myosine lichte keten kinase dat bindt aan CAM) sequenties. De CaM-M13 sequentie is gemodificeerd voorkomen M13 binden aan endogene calmoduline. Ook naar SR behoud te verzekeren, een calsequestrin reeks is toegevoegd aan het 5'einde van de ^GVB-11. Wanneer gebonden aan Ca2 ^+, de CaM-M13 domein gaat door conformationele veranderingen die resulteren in een verhoging van de energieoverdracht tussen de flankerende CFP en YFP, die wordt geregistreerd als een toename van de FRET signaalintensiteit. Anderzijds, wanneer de concentratie van SR luminale Ca2 ⁺ daalt, de CaM-M13 domein gaat door reverse conformationele veranderingen, resulterend in een afname van de energieoverdracht tussen de flankerende CFP en YFP en een aanzienlijke daling van FRET signaalintensiteit .

Protocol

Ethiek statement: Alle experimenten en procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Laboratory Biosafety richtlijnen van de Universiteit van British Columbia, Vancouver, Canada. 1. Bereiding van 35 mm Glass-bottom Cultuur Gerechten voor FRET-gebaseerde confocale microscopie Bereid platen met de volgende procedure 36-48 h voorafgaand aan experimenten. Ophalen gekozen gelatineuze eiwitmengsel en 0,25% trypsine-EDTA van -20 ° C opslag en bewaar ze in de mobiele ijsbad tot gebruik. <b…

Representative Results

Deze sectie geeft voorbeelden van de resultaten die kunnen worden verkregen volgens de werkwijze die werd beschreven SR luminale Ca2 + -concentratie data vastleggen, vergeleken met de gewoonlijk gebruikte wijze van indirect meten van veranderingen in Ca2 + concentraties organel opslag door het observeren schommelingen in cytoplasmatische Ca2 + . Figuur 1A toont een momentopname…

Discussion

Dit protocol beschrijft de transfectie van VSMCs de D1SR adenovirus Ca2 ⁺ concentraties bestuderen binnen het lumen van de SR. Deze werkwijze maakt het direct meten van Ca2 ⁺ in het organel en zijn beweging naar / uit de SR als gevolg van de toepassing van verschillende calcium bewegende middelen. Deze methode heeft veel voordelen voor onderzoekers werken aan een beter begrip van hoe veranderingen in SR en cytoplasmatische Ca ²⁺ niveaus invloed op de algehele gezondheid van de cellen en …

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.