Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca ²⁺ ist ein sehr wichtiger Ionen im Überfluss in jeder einzelnen Zelle im Körper gefunden. Es hat eine bedeutende Rolle in vielen verschiedenen Zellfunktionen, einschließlich Wachstum, Proliferation, Migration und Apoptose ^1-4. Es ist bekannt, dass Ca ²⁺ diese Prozesse durch direkte und indirekte Aktionen beeinflussen können, und daher Änderungen an den normalen intrazellulären Konzentrationen dieses Ions in negativen Folgen für die betroffenen Zellen leicht zur Folge haben kann. Der SR wird als die größte intrazellulären Ca ²⁺ Speicher innerhalb der Zelle ⁵ betrachtet. Steady – State – Niveaus von Ca ²⁺ sowohl in der SR und Zytoplasma werden in der Regel durch konstanten Fluss in die und aus der ²⁺ -transportierenden Kanäle dieses Organell Ca gehalten. Die Stressbedingungen auf Zellen auferlegt aufgrund irgendeiner Form von Verletzungen oder Erkrankungen sind häufig mit erheblichen Veränderungen in der SR Ca ²⁺ zugeordnet , die auf langfristige Auswirkungen auf das zu haben , gehen eralth der Zelle. In der schwersten Fällen die Unfähigkeit eines gestressten Zelle erholen und stetigen Ca Zustand SR halten ²⁺ -Spiegel auch im Tod durch Apoptose ^6-8 gipfeln kann.

Die aktuelle Forschung in zelluläre Ca ²⁺ Dynamik wird durch die Tatsache , dass nur wenige Studien Test Ca ²⁺ Speicherinhalt direkt ^9-11 Organell. Die am weitesten verbreitete Praxis beinhaltet stattdessen Messung der cytoplasmatischen Ca ²⁺ -Spiegel als indirekte Messungen von Veränderungen in der SR Ca ²⁺ -Gehalt ^12-14. In diesen Experimenten wird ²⁺ Ca häufig induziert vom SR durch die Verwendung von pharmakologischen Mitteln freigesetzt werden verursacht die Abreicherung des Organell (zB Thapsigargin). Schlussfolgerungen werden dann im Hinblick auf Änderungen an SR Ca ²⁺ basierend auf Schwankungen der cytoplasmatischen Ca ²⁺ Konzentrationen gezogen. Trotz der Möglichkeit, für die Ermittler noch auf solche Schlussfolgerungen in einem Kreisverkehr ma ziehennner, diese Methode der SR Ca ²⁺ -Messung ist eindeutig ein indirekter Weg , solche Informationen zu sammeln, mit vielen Einschränkungen die Interpretation der gesammelten Daten. Um diese Einschränkung zu umgehen klar, ist es notwendig , die Menge an Ca ²⁺ gefunden direkt innerhalb des SR luminalen Netzwerk zu messen.

Entscheidend für das Endergebnis in der Lage, intraluminale SR Ca ²⁺ -Spiegel direkt aufzuzeichnen sind die Zellkultur – Tools und die Ca ²⁺ Indikator verwendet. Für die Daten im aktuellen Manuskript Bezug genommen wird, ist es wichtig zu beachten, dass verwendet VSMCs aus einer gefrorenen Zelllinie kam. Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% Serum von neugeborenen Kälbern (NCS) über Durchgänge 22-26 für die skizzierten Versuche bei einer konstanten 37 ° C mit 5% CO ₂ -Zufuhr inkubiert. Verwendung der aktuellen Methode, beispielsweise wurden auf einem Proteingemisch Zellen sehr erfolgreich gezüchtet, die die extrazelluläre simuliertUmgebung von vielen verschiedenen Arten von Gewebe ^15. Wichtig für den Erfolg entlang der Vene von SR Ca ²⁺ Forschung ist die Art der Proteinmischung verwendet; in diesem Fall war eine niedrige Wachstumsfaktor Vielfalt notwendigen Komponenten dieses Werkzeugs zu vermeiden , die aus dem regulären Ca ²⁺ Signalisierung zu beeinflussen und Bewegungen ständig innerhalb der getesteten Zellen auftreten. Nach dem erfolgreichen Wachstum von Testzellen, muss die Ca ²⁺ Indikator auch wirksam auf diese kultivierten Zellen eingebracht werden. Dies ist möglich geworden durch einen Adenovirus – Vektor verwendet, die die SR-Wohnsitz Ca ²⁺ trägt Indikator D1SR. Um eine hohe Transfektionseffizienz Zellen erreichen, müssen mit viralen Vektoren für mindestens 36-48 h vor der Bebilderung inkubiert werden. Dieses Präparat stellt ein zuverlässiges Werkzeug Ca ²⁺ Transienten innerhalb der SR – Lumen mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu messen.

D1SR Indikator in diesem Protokoll verwendet eine modifizierte Variante des D1ER Ca ²⁺ iNDIKATOR , die ursprünglich an der University of California von Dr. Roger Tsien Labor erstellt, San Diego, USA ^9,16. Die ursprüngliche D1ER gehört zu einer zweiten Generation von genetisch Ca ²⁺ codiert Indikatoren genannt Chamäleons , die ^9,16 Ca ²⁺ Empfindlichkeiten über einen viel breiteren Bereich (0,5 bis 160 & mgr; M) im Vergleich zur vorherigen Ca ²⁺ Indikatoren anzeigen. Die neue Variante D1SR ein freundliches Geschenk von Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Canada), trägt jedoch eine mutante Calsequestrin Sequenz (anstelle eines Calreticulin-Sequenz, wie in der ursprünglichen D1ER). Die Mutante Calsequestrin hat Ca ²⁺ eine reduzierte Bindung , die bei der Bindung an Ca ²⁺ innerhalb des SR Lumen ¹¹ das Problem der im Wettbewerb mit endogenen Calsequestrin eliminiert. Der D1SR Indikator trägt ein verkürztes verstärkt cyan fluoreszierendes Protein (GFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP), dass binden durch einen Linker-Protein enthält modifizierte Calmodulin (CaM) und M13 (ter 26-Rest-Peptid von Myosin-Leichtketten-Kinase, die an CaM) Sequenzen bindet. Die CaM-M13-Sequenz wurde modifiziert, M13, um zu verhindern, um endogene Calmodulin binden. Auch, um SR Retentions gewährleisten, ist eine Calsequestrin Sequenz wurde am 5'Ende der CFP ¹¹ hinzugefügt. Wenn gebunden an Ca ^2+, geht die CaM-M13 – Domäne durch Konformationsänderungen , die in einer Erhöhung der Energieübertragung zwischen den flankierenden CFP und YFP führen, was als ein Anstieg in der FRET – Signalintensität aufgezeichnet. Auf der anderen Seite, wenn die Konzentration von SR luminalen Ca ²⁺ abfällt, geht die CaM-M13 – Domäne durch Reverse Konformationsänderungen, was zu einer Verringerung der Energieübertragung zwischen den flankierenden CFP und YFP und einem signifikanten Abfall der Signalintensität FRET .

Protocol

Ethik-Anweisung: Alle Experimente und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Laboratory Biosafety-Richtlinien von der University of British Columbia, Vancouver, Kanada durchgeführt. 1. Herstellung von 35 mm Glasbodenkulturschalen für FRET-basierte konfokale Mikroskopie Bereiten Sie Platten mit dem folgenden Verfahren 36-48 Stunden vor den Experimenten. Abrufen gewählt gallertartig Proteinmischung und 0,25% Trypsin-EDTA von -20 ° C Lagerung und halten sie in mobilen Eisbad bis zur V…

Representative Results

In diesem Abschnitt werden Beispiele für die Ergebnisse , die unter Verwendung der beschriebenen Verfahren erhalten werden kann , SR luminalen Ca 2+ -Konzentration Daten zu erfassen, im Vergleich zu der üblicherweise verwendeten Art indirekt Änderungen Messung Ca 2+ store Konzentrationen Organell durch Schwankungen in cytoplasmatischen Ca 2+ beobachtet . 1A zeigt eine Moment…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Transfektion von VSMCs mit dem D1SR Adenovirus Ca ²⁺ -Konzentrationen in dem Lumen des SR zu studieren. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Messung von Ca ²⁺ in diesem Organell sowie seine Bewegung in den / aus dem SR als Ergebnis der Anwendung von unterschiedlichen Calcium bewegenden Agenten. Diese Methode hat viele Vorteile für die Forscher arbeiten an einem umfassenden Verständnis der Auswirkungen von Änderungen an SR und cytoplasmatischen Ca ²⁺…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.