Misura di fluttuazioni calcio all'interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca ²⁺ è uno ione molto importante si trova in abbondanza all'interno di ogni singola cellula del corpo. Ha ruoli significativi in molte funzioni cellulari diverse, tra cui la crescita, la proliferazione, la migrazione e l'apoptosi ^1-4. E 'ben noto che la Ca ²⁺ può influenzare questi processi attraverso azioni dirette e indirette, e di conseguenza, le modifiche ai normali concentrazioni intracellulari di questo ione può facilmente portare a risultati negativi per le cellule colpite. Il SR è considerato come il più grande intracellulare Ca ²⁺ negozio all'interno della cella ^5. I livelli di stato stazionario di Ca ²⁺ sia nel SR e nel citoplasma sono normalmente mantenuti attraverso il flusso costante dentro e fuori le Ca ²⁺ -transporting canali di questo organello. Le condizioni di stress imposte sulle cellule a causa di qualsiasi forma di lesioni o malattie sono comunemente associati con cambiamenti significativi nella SR Ca ²⁺ che andare avanti per avere effetti duraturi sulla eglialth della cella. Nel più grave dei casi, l'incapacità di una cellula stressata per recuperare e mantenere lo stato stazionario SR Ca ^{2 +} livelli possono anche culminare nella morte per apoptosi ^6-8.

La ricerca attuale in cellulari Ca ²⁺ dinamica è limitata dal fatto che pochi studi di prova organello Ca ²⁺ contenuto negozio direttamente ^9-11. La pratica più comune prevede invece la misura di citoplasmatici di Ca ²⁺ livelli come misure indirette dei cambiamenti in SR Ca ²⁺ contenuti ^12-14. In questi esperimenti, Ca ²⁺ viene indotto ad essere rilasciato dalla SR attraverso l'uso di agenti farmacologici che causano deplezione del organello (es thapsigargin). Le conclusioni sono poi disegnati in relazione alle modifiche SR Ca ²⁺ sulla base fluttuazioni dei citoplasmatici di Ca ²⁺ concentrazioni. Nonostante la capacità residua per gli investigatori di trarre tali conclusioni in una rotonda manner, questo metodo di SR Ca ²⁺ misura è chiaramente un modo indiretto per raccogliere tali informazioni, con molte limitazioni relative all'interpretazione dei dati raccolti. Per aggirare questo chiaro restrizione, è necessario misurare la quantità di Ca ²⁺ trovato direttamente all'interno della rete luminale SR.

Vitale per il risultato finale di essere in grado di registrare direttamente endoluminali SR livelli di Ca ²⁺ sono gli strumenti di coltura cellulare e l'indicatore di Ca ²⁺ utilizzato. Per i dati di riferimento nel manoscritto attuale, è importante notare che VSMC utilizzati provenivano da una linea cellulare congelati. Le cellule sono state coltivate in terreno Dulbecco Modified Eagle (DMEM) + 10% di siero di vitello neonato (NCS) su passaggi 22-26 per gli esperimenti descritti, incubate a una costante 37 ° C con 5% di CO ₂ di alimentazione. Utilizzando il metodo attuale, per esempio, le cellule sono state coltivate con successo su una miscela di proteine ​​che simula il extracellulareambiente di molti diversi tipi di tessuto ^15. Importante per il successo lungo la vena della SR Ca ²⁺ ricerca è il tipo di miscela proteina utilizzata; in questo caso, una varietà a basso fattore di crescita era necessario evitare componenti di questo strumento comprometta il regolare Ca ²⁺ segnalamento e movimenti costantemente avvenuto nelle cellule testate. Dopo crescita di successo di celle di prova, l'indicatore Ca ²⁺ deve essere effettivamente introdotto a queste cellule in coltura. Questo è diventato possibile utilizzando un vettore adenovirale che porta il SR-residente Ca ²⁺ indicatore D1SR. Per ottenere una elevata efficienza di trasfezione, le cellule devono essere incubate con vettori virali per almeno 36-48 ore prima di imaging. Questa preparazione fornisce uno strumento affidabile per misurare Ca ²⁺ transitori all'interno del lume SR con elevata precisione e riproducibilità.

Indicatore D1SR utilizzato in questo protocollo è una variante modificata del D1ER Ca ²⁺ indicator che è stato originariamente creato dal laboratorio del Dr. Roger Tsien presso l'Università della California, San Diego, USA ^9,16. Il D1ER originale appartiene a una seconda generazione di geneticamente codificati Ca ²⁺ indicatori chiamati Cameleons che visualizzano Ca ²⁺ sensibilità su una gamma molto più ampia (0,5-160 micron) rispetto ai precedenti Ca ²⁺ indicatori ^9,16. Il nuovo D1SR variante, un gentile dono del Dr. Wayne Chen (Università di Alberta, Canada), tuttavia, comporta una sequenza calsequestrina mutante (invece di una sequenza calreticulin come nel D1ER originale). Il calsequestrina mutante ha una ridotta vincolante per Ca ²⁺ che elimina il problema di competere con calsequestrina endogena nel legame di Ca ²⁺ all'interno della SR lume ^11. L'indicatore D1SR trasporta una proteina fluorescente troncata migliorato ciano (PCP) e di proteine ​​di colore giallo fluorescente (YFP) che si legano da una proteina linker contenente calmodulina modificato (CAM) e M13 (tegli peptide di 26 residui di miosina chinasi luce-catena che lega a camma) sequenze. La sequenza CAM-M13 è stato modificato per evitare M13 di legarsi a calmodulin endogena. Inoltre, per evitare la fuoriuscita SR, una sequenza calsequestrina è stato aggiunto all'estremità 5'della PCP ^11. Quando è legato al Ca ^2+, il dominio CaM-M13 passa attraverso cambiamenti conformazionali che provocano un aumento del trasferimento di energia tra la PCP accompagnamento e YFP, che viene registrato come un aumento dell'intensità del segnale FRET. D'altra parte, quando la concentrazione di SR luminale Ca ²⁺ gocce, il dominio CaM-M13 passa attraverso cambiamenti conformazionali inversa, con una conseguente diminuzione del trasferimento di energia tra la PCP accompagnamento e YFP, e un calo significativo dell'intensità del segnale FRET .

Protocol

dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti e le procedure sono state condotte in accordo con le linee guida Laboratory Biosafety della University of British Columbia, Vancouver, Canada. 1. Preparazione di 35 mm con fondo di vetro piatti della cultura per FRET-based Microscopia confocale Preparare piatti utilizzando la hr seguente procedura 36-48 prima di esperimenti. Recupera miscela proteica gelatinosa scelto e lo 0,25% tripsina-EDTA da -20 ° C di stoccaggio e tenerli in bagno di ghiaccio …

Representative Results

Questa sezione fornisce esempi dei risultati che si possono ottenere con il metodo descritto per acquisire dati di concentrazione SR luminali di Ca 2+, rispetto al modo comunemente impiegato per misurare indirettamente modifiche organelli concentrazioni negozio Ca 2+ osservando fluttuazioni citoplasmatica di Ca 2+ . La figura 1A mostra un'istantanea di una regione di intere…

Discussion

Questo protocollo descrive la transfezione di VSMCs con l'adenovirus D1SR per studiare Ca ²⁺ concentrazioni all'interno del lume del SR. Questo metodo consente la misura diretta di Ca ²⁺ all'interno di questo organello nonché il suo movimento in / out della SR in conseguenza dell'applicazione di diversi agenti calcio-movimento. Questo metodo ha molti vantaggi per gli investigatori che lavorano per una comprensione completa di come i cambiamenti a SR e citoplasmatici di Ca ^2+</…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.